位于2号染色体与紫花苜蓿刈割后株高再生能力相关的分子标记及应用

本发明属于生物，具体涉及一种位于2号染色体与紫花苜蓿刈割后株高再生能力相关的indel分子标记及应用。

背景技术：

0、技术背景

1、紫花苜蓿(medicago sativa l.)为最为重要的豆科饲草植物，由于其营养价值高，适口性好，粗蛋白、维生素和矿物质含量丰富，氨基酸的组成比较齐全，因而具有“牧草之王”的美誉。且其适应性强、生长速度快、年限长，可频繁刈割，在现代农牧业生产中的地位越来越突出。在我国北方主要牧草产区，紫花苜蓿一年一般收割2～4茬。再生性虽然取决于牧草自身的生物学特性，但也会受到生长环境和管理因素的制约。在一定的刈割条件下牧草的快速生长对牧草高产性能具有重要影响。

2、全基因组关联分析(genome-wide association studies，gwas)在育种领域中备受关注，通过分析大量的遗传标记与目标性状之间的关联，可以识别出与性状相关的关键基因或位点。这项技术的研发和应用已经成为当前育种领域的重要热点和竞争领域之一。分子标记是植物基因分型、品种鉴定、遗传多样性分析和辅助育种的重要工具。除了广泛应用的ssr(simple sequence repeats)和snp(single nucleotide polymorphism)标记之外，indel(insertion-deletion)因其含量丰富且具共显性的特点，也受到了人们的关注。本发明利用231份紫花苜蓿材料构建群体，并对其进行重测序，结合再生株高性状开发一个与株高再生能力相关的indel位点。对于构建辅助选择育种体系、种质资源的改良、新品种选育等具有重要的意义。

技术实现思路

1、本发明的目的之一在于提供了一种与紫花苜蓿刈割后株高再生能力相关的indel分子标记。

2、本发明的目的之二在于提供上述与紫花苜蓿刈割后株高再生能力相关的indel分子标记的应用。

3、为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：

4、本发明公开的刈割后株高再生能力相关的indel分子标记，位于紫花苜蓿第2号染色体上，所述分子标记命名为ms_chr2_64484137。

5、扩增与紫花苜蓿株高再生能力相关的indel分子标记的引物对，所述分子标记ms_chr2_64484137对应的引物对序列为：

6、ms_chr2_64484137-f：tctgtggaaataatattctcgtggt(seq id no.1所示)；

7、ms_chr2_64484137-r：ggaatagcagttgttgaccattga(seq id no.2所示)。

8、本发明还公开了上述分子标记引物对在紫花苜蓿刈割后再生株高辅助育种中的应用。也就是说本发明的分子标记可用于今后的分子标记辅助育种中，通过苗期提取叶片的dna，检测是否存在本发明的分子标记，进而来鉴定紫花苜蓿材料的再生株高相关性状，从而确定紫花苜蓿株高再生能力的强弱。所述检测可以使用pcr检测的方法，具体可以使用上述的分子标记引物对，所述检测还可以通过测序方法进行。

9、本发明还公开了上述分子标记在鉴定紫花苜蓿刈割后再生株高性状中的应用，尤其是在筛选和鉴定紫花苜蓿刈割后株高再生能力中的应用。具体地，用于鉴定紫花苜蓿刈割后再生株高性状具体步骤如下：

10、(1)以供试种质的dna为pcr扩增的模板，以上述分子标记ms_chr2_64484137对应的引物对进行pcr扩增，pcr扩增的反应体系如表1：

11、表1 pcr扩增的反应体系

12、

13、94℃预变性4min；94℃变性30s，54.5℃退火24s，72℃延伸24s，40个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

14、(2)pcr产物的琼脂糖凝胶电泳检测：取4μl，根据条带的结果判断紫花苜蓿株高性状的结果。

15、利用引物对ms_chr2_64484137-f、ms_chr2_64484137-r进行pcr扩增，如果pcr扩增产物仅有一条如seq id no.4所示的长度为200bp的特征条带，则紫花苜蓿为矮秆(株高再生能力弱)类型；如果pcr扩增产物仅有一条如seq id no.5所示的长度为175bp的特征条带，则紫花苜蓿为高杆(株高再生能力强)类型；或者既有一条如seq id no.4所示的长度为200bp的特征条带，又有一条如seq id no.5所示的长度为175bp的特征条带，则紫花苜蓿为半矮杆(株高再生能力中等)类型。

16、另外，本发明还保护一种用于鉴定紫花苜蓿株高再生能力性状的试剂盒，所述试剂盒中包含引物对ms_chr2_64484137-f、ms_chr2_64484137-r。所述试剂盒的其它成分均属于常规的试剂。具体还包括10×pcr buffer、dntp和taq dna聚合酶。本发明对所述引物对的浓度没有特殊限制，采用本领域所熟知的引物浓度即可。本发明对所述10×pcrbuffer、dntp和taq dna聚合酶的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的普通pcr扩增用试剂即可。

17、采用本发明的试剂盒可以快速的鉴定紫花苜蓿刈割后株高再生能力，还可以快速的鉴定紫花苜蓿刈割后株高基因型。具体方法参照鉴定紫花苜蓿刈割后再生株高性状的具体步骤，通过对pcr扩增产物进行电泳检测和/或测序，如果pcr扩增产物仅有一条如seq idno.4所示的长度为200bp的特征条带，则紫花苜蓿为纯合矮杆(株高再生能力弱)基因型；如果pcr扩增产物仅有一条如seq id no.5所示的长度为175bp的特征条带，则紫花苜蓿为纯合高杆(株高再生能力强)基因型；如果pcr扩增产物既有一条如seq id no.4所示的长度为200bp的特征条带，又有一条如seq id no.5所示的长度为175bp的特征条带，则紫花苜蓿为杂合半矮秆(株高再生能力中等)基因型。

18、本发明具有如下优点：

19、(1)本发明的发明人筛选出了一个与紫花苜蓿刈割后株高再生能力相关的分子标记ms_chr2_64484137，该分子标记位于2号染色体上，采用本发明的分子标记ms_chr2_64484137可以快速的对紫花苜蓿刈割后的株高再生能力进行准确的鉴定。

20、(2)用与刈割后株高再生能力连锁的标记来进行筛选，有利于分子标记辅助选择育种，其方法简单可行，有利于提高效率，节省成本。

21、(3)本发明的分子标记具有检测方便、扩增产物稳定、特异性高的特点，可以简便、快速、高通量地应用于紫花苜蓿刈割后株高再生能力育种实践及材料鉴定。

技术特征：

1.位于2号染色体与紫花苜蓿刈割后株高再生能力相关的indel分子标记，其特征在于，所述indel分子标记对应的引物对序列为：

2.权利要求1所述的indel分子标记在紫花苜蓿分子标记辅助育种中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述indel分子标记用于鉴定或辅助鉴定紫花苜蓿的刈割后株高的再生能力。

4.一种紫花苜蓿刈割后株高再生能力鉴定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

5.一种用于紫花苜蓿刈割后株高再生能力鉴定的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1中所述的引物对。

6.权利要求5所述的试剂盒在鉴定紫花苜蓿刈割后株高再生能力基因型方面的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，利用所述试剂盒对紫花苜蓿刈割后株高再生能力基因型进行鉴定的方法为：

技术总结
本发明属于分子标记技术领域，公开了一种位于2号染色体与紫花苜蓿刈割后株高再生能力相关的InDel分子标记及应用，本发明通过测定刈割两周后紫花苜蓿再生的株高来体现紫花苜蓿刈割后一定时间内植株再生的能力。所述InDel分子标记位于紫花苜蓿第2号染色体上，插入或缺失片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示。用于扩增InDel分子标记的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示。本发明所述InDel分子标记及其引物对能够鉴定或辅助鉴定紫花苜蓿刈割后株高再生能力。同时本发明还提供了利用所述InDel分子标记快速鉴定紫花苜蓿刈割后株高再生能力的方法，该方法简便快捷，鉴定结果准确，具有良好的推广应用前景。

技术研发人员：刘文献,曾子沁,冯雅琪,陈嘉慧,刘志鹏
受保护的技术使用者：兰州大学
技术研发日：
技术公布日：2024/11/26