碱性木聚糖酶突变体的制作方法

本发明涉及基因工程与蛋白质工程，具体涉及一种碱性木聚糖酶突变体。

背景技术：

1、造纸行业一直是污染严重的行业，近年来随着我国对环保越来越重视及污染治理力度的加强，对制浆造纸工艺的要求也越来越高，无论是在生产工艺的改进还是造纸助剂的添加方面均向着绿色环保的方向发展。生物酶在制浆造纸工业中的应用越来越广泛，在工艺流程的各个阶段，如蒸煮、漂白、打浆、废纸脱墨、胶粘物控制等方面均有应用。生物酶在制浆漂白中应用的研究是近几年生物酶在造纸中应用的一个热点，在漂白过程中加入生物酶，能够减少化学漂剂的用量，提高纸浆漂后白度，减少漂白废液中离子垃圾含量，提高白水循环利用率。常用于纸浆漂白中的酶制剂有木聚糖酶和漆酶。

2、广义上的木聚糖酶是指一类能够降解大量存在于自然界尤其是植物纤维中的半纤维素木聚糖的复合酶系，包括β-1, 4-内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-l-阿拉伯糖苷酶等。而狭义的木聚糖酶主要是指β-1,4-内切木聚糖酶。β-1,4-内切木聚糖酶主要是作用于木聚糖分子中的β-1,4-糖苷键，通过切断β-1,4-糖苷键从而使木聚糖降解为小分子的低聚木糖诶寡糖及木二糖等，以及一些量很少的木糖和阿拉伯糖。β-木糖苷酶及 α-l-阿拉伯糖苷酶等主要是使低聚木糖进一步降解为单糖，从而使木聚糖彻底降解为单糖。

3、木聚糖酶的来源较为广泛，自然界中的动、植物以及微生物都能产生木聚糖酶。其中微生物是木聚糖酶最广泛的来源，目前对木聚糖酶的筛选研究也大多是从微生物入手，主要是一些细菌和真菌。研究表明：细菌分泌的木聚糖酶既有酸性的也有碱性的，而真菌分泌的木聚糖酶则只有碱性木聚糖酶。因此可以根据对木聚糖酶的实际应用要求对其菌种进行筛选。目前木聚糖酶的生产主要是通过对细菌及真菌等进行发酵来实现。

4、目前木聚糖酶已被广泛应用在制浆造纸工业中，其中应用最多的是作为漂白助剂应用在制浆造纸工艺的漂白工段。许多研究发现，木聚糖酶预处理可以提高纸浆漂白性能，提高漂后纸浆的成纸白度。garg等使用来源于bacillus stearothermophilus sdx 的木聚糖酶在 60℃、时间 120 min 的条件下处理浆料，发现酶处理后的纸浆白度提高了 4.75%。另外，国内外许多浆厂应用之后发现，木聚糖酶加入在漂白工段前，在达到要求白度下可降低化学浆漂白成本，漂白负荷可降低约5%~20%。

5、然而，由于在实际生产过程中纸浆漂白的环境多为高温偏碱环境，一般的木聚糖酶在其中难以存活，很难起到作用效果，因此，需要研发具有耐温耐碱的木聚糖酶。本发明通过蛋白质工程这一手段，制备出具有耐温耐碱特性的木聚糖酶，可广泛应用于造纸行业中。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种新型碱性木聚糖酶突变体。所述突变体的耐热性得到显著提高，有利于其在造纸领域的广泛应用。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明涉及一种木聚糖酶突变体，其包含与seq id no:1具有至少90%同一性的氨基酸序列，且与seq id no:1相比在选自下组中的至少一个位置上包含氨基酸的取代：24，38，40，41，56，57，59，61，75，80，103，107，114，129，132，135，143，144，149，151，154，157，160，165，166，167，177，192。

4、在本发明的一些实施例中，所述突变体的氨基酸序列与seq id no:1相比具有至少91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，或至少99%的同一性。

5、在一些更具体的实施例中，所述突变体的氨基酸序列与seq id no:1相比具有至少99.1%，99.2%，99.3%，99.4%，99.5%，99.6%，99.7%，99.8%，或至少99.9%的同一性。

6、在本发明的一些实施例中，所述突变体包含下组中至少一个氨基酸的取代：q24p，s38v/k/w/h/t/i，g40m/r/k/f/h，d41p，n56l/i/p/k，a57e/d/y，a59k/r/i/m/h，h61f/y，a75s，t80m，t103i，t107e，t114y，d129l，q132r/m，d135m，n143d，k144r，t149l，q151n/y，c154n，d157e，a160e，n165d，v166i，n167s/w，t177v，d192e。

7、本发明还涉及编码上述木聚糖酶突变体的dna分子。

8、本发明还涉及包含上述dna分子的重组表达载体。

9、本发明还涉及一种宿主细胞，包含上述重组表达载体。

10、将上述的质粒转入宿主细胞中，重组表达的木聚糖酶突变体的耐热性和耐碱性得到显著提升。

11、在本发明的一些实施例中，宿主细胞为毕赤酵母（ pichia pastoris）。

12、在本发明的一些实施例中，宿主细胞为里氏木霉（ trichoderma reesei）。

13、本发明还提供了上述木聚糖酶突变体在造纸领域中的应用。

14、本发明以野生型木聚糖酶h1为基础，提供了包含q24p，s38v/k/w/h/t/i，g40m/r/k/f/h，d41p，n56l/i/p/k，a57e/d/y，a59k/r/i/m/h，h61f/y，a75s，t80m，t103i，t107e，t114y，d129l，q132r/m，d135m，n143d，k144r，t149l，q151n/y，c154n，d157e，a160e，n165d，v166i，n167s/w，t177v，d192e中至少一个突变位点的突变体。与野生型木聚糖酶h1相比，本发明提供的单点突变体在75℃条件下的相对酶活普遍提高了12.2%-71.4%。其中，含s38t、s38w、d41p、t177v单点的突变体在75℃条件下的相对酶活均超过80%，远高于野生型木聚糖酶h1，取得了意料不到的技术效果。

15、在ph9.0-11.0条件下处理2h后，野生型木聚糖酶h1及其单点突变体的酶活残留率普遍高于91%，几乎没有酶活损失；

16、在ph12.0条件下处理2h后，野生型木聚糖酶h1的酶活残留率仅为45.06%，而木聚糖酶单点突变体的酶活残留率高达61.51-93.29%，尤其是含s38t、s38w、d41p、t177v单点的突变体酶活残留率分别高达90.6%、92.33%、93.11%和93.29%。从而说明，本发明提供的单点突变体对碱性环境的耐受性得到显著提高，取得了意料不到的技术效果。

17、综上，本发明提供的木聚糖酶突变体对高温和碱性环境的耐受性得到显著提高，从而有利于木聚糖酶在造纸领域中的广泛应用。

技术特征：

1.一种木聚糖酶突变体，其特征在于，所述突变体是氨基酸序列为seq id no:1的木聚糖酶的第41位氨基酸由asp变为pro。

2.编码权利要求1所述木聚糖酶突变体的dna分子。

3.包含权利要求2所述dna分子的重组表达质粒。

4.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞包含权利要求3所述的重组表达质粒。

5.如权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为毕赤酵母（pichia pastoris）。

6.如权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为里氏木霉（trichoderma reesei）。

7.权利要求1所述木聚糖酶突变体在造纸领域中的应用。

技术总结
本发明涉及基因工程与蛋白质改造技术领域，具体涉及一种新型碱性木聚糖酶突变体。本发明以野生型木聚糖酶H1为基础，提供了包含Q24P，S38V/K/W/H/T/I，G40M/R/K/F/H，D41P，N56L/I/P/K，A57E/D/Y，A59K/R/I/M/H，H61F/Y，A75S，T80M，T103I，T107E，T114Y，D129L，Q132R/M，D135M，N143D，K144R，T149L，Q151N/Y，C154N，D157E，A160E，N165D，V166I，N167S/W，T177V，D192E中至少一个突变位点的突变体。所述突变体的对高温和碱性环境的耐受性得到显著提高，有利于其在造纸领域的广泛应用。

技术研发人员：吴秀秀,李馨培
受保护的技术使用者：青岛蔚蓝生物集团有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/12/2