一种咪鲜胺包被抗原、免疫抗原以及单克隆抗体和应用

本发明涉及免疫检测，具体涉及一种咪鲜胺包被抗原、免疫抗原以及单克隆抗体和应用。

背景技术：

1、咪鲜胺(prochloraz)，化学式为c15h16cl3n3o2，是一种咪唑类杀菌剂，主要通过抑制真菌细胞内麦角固醇生物合成途径中的c-14脱甲基酶(cyp51)活性，阻断羊毛固醇向麦角固醇的转化，干扰真菌细胞膜的合成，从而抑制真菌生长和繁殖。

2、咪鲜胺广泛用于园艺和农业，有效预防谷物、水果和蔬菜的真菌病，并作为多数水果的采后保鲜剂使用。然而，其使用量的增加，加深了其在环境中的残留风险，咪鲜胺在水体、水生生物及食品中均有检测到。

3、咪鲜胺在动植物体内可被代谢为多种物质，包括bts44596、bts44595、bts44770、bts9608和bts45186等。其中，bts44595、bts44596和2,4,6-三氯苯酚为主要代谢物，在动植物体内具有较长的稳定性。这些代谢物在高淀粉植物中于-18℃下可稳定6个月，在动物源性食品中冷冻储存至少稳定3个月，2,4,6-三氯苯酚在玉米中稳定长达24个月，在肌肉、鸡蛋和牛奶中稳定12个月。

4、咪鲜胺对人类和动物具有毒理学风险，尤其在生殖毒性方面对男性影响显著，可能影响男性激素分泌，增加男性婴儿女性化风险。它还具有内分泌干扰特性和遗传毒性，可能损害人类呼吸系统和神经系统。在动物中，咪鲜胺可导致性分化问题、生长发育影响等。

5、鉴于咪鲜胺及其代谢物的稳定性和对人类及动物健康的潜在影响，建立有效的检测方法至关重要。目前咪鲜胺的检测方法主要包括液相色谱-串联质谱(lc-ms/ms)、气相色谱(gc)、高效液相色谱(hplc)和气相色谱-质谱(gc-ms)，以及一些比色和电化学方法。这些方法虽灵敏度高、特异性强，但操作复杂、成本高，不适合快速现场检测。

6、现有研究中，咪鲜胺的抗体仅能检测咪鲜胺本身，无法识别其代谢物，限制了其在多国残留检测标准中的应用。因此，开发一种能够同时检测咪鲜胺及其代谢物的广谱特异性抗体，并利用该抗体开发可靠的免疫分析方法，对于提高检测效率、保障食品安全具有重要意义。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目在于提供一种咪鲜胺包被抗原、免疫抗原以及单克隆抗体和应用，通过将咪鲜胺包被半抗原与载体蛋白偶联制备完全抗原，其特异性好，灵敏度高，能够用于建立咪鲜胺其代谢物的酶联免疫检测方法。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种咪鲜胺包被半抗原，具有式b所示结构：

4、

5、本发明提供了上述技术方案所述的咪鲜胺包被半抗原的制备方法，包括以下步骤：

6、将具有式1所示结构的咪鲜胺与浓盐酸混合，进行酸解反应，得到具有式2所示结构的化合物；

7、

8、在三乙胺的作用下，具有式3所示结构的化合物与三光气进行异氰酸酯化反应，得到具有式4所示结构的化合物；

9、

10、在三乙胺的作用下，所述具有式2所示结构的化合物与具有式4所示结构的化合物进行加成反应，得到具有式5所示结构的化合物；

11、

12、在碱性条件下，具有式5所示结构的化合物进行水解反应，调节ph值至酸性后得到具有式b所示结构的咪鲜胺包被半抗原。

13、本发明提供了一种咪鲜胺包被抗原，由上述技术方案所述的咪鲜胺包被半抗原或所述制备方法制备得到的咪鲜胺包被半抗原与载体蛋白偶联得到；所述咪鲜胺包被抗原具有式f所示结构：

14、

15、本发明提供了一种咪鲜胺免疫抗原，具有式e所示结构：

16、

17、本发明提供了一株杂交瘤细胞株mxa 9c3，其保藏号为cgmccno.45936；

18、所述杂交瘤细胞株mxa 9c3由权利要求4所述的咪鲜胺免疫抗原免疫宿主得到。

19、本发明提供了一种抗体，由上述技术方案所述的杂交瘤细胞株mxa 9c3分泌产生。

20、本发明提供了一种检测产品，所述检测产品中包括上述技术方案所述的咪鲜胺包被半抗原，或所述制备方法得到的咪鲜胺包被半抗原，或所述的咪鲜胺包被抗原，或所述的咪鲜胺免疫抗原，或所述的杂交瘤细胞株mxa 9c3，或所述的抗体。

21、优选的，所述产品包括试剂、试剂盒和胶体金试纸条中的一种或多种。

22、本发明提供了上述技术方案所述的咪鲜胺包被半抗原，或所述制备方法得到的咪鲜胺包被半抗原，或所述的咪鲜胺包被抗原，或所述的咪鲜胺免疫抗原，或所述的杂交瘤细胞株mxa 9c3，或所述的抗体，或所述的检测产品在检测咪鲜胺及其代谢物中的应用。

23、优选的，所述代谢物包括代谢bts44595和/或代谢物bts44596。

24、有益效果：

25、本发明提供了一种咪鲜胺包被半抗原，具有式b所示结构。本发明以此半抗原作为异源包被原，能够提升抗体的亲和力，且此咪鲜胺包被半抗原具有良好的溶解性和稳定性。

26、本发明提供了上述的制备方法，此法合成路径较简单，合成成本低，易于实现工业化批量生产。

27、本发明提供了一种咪鲜胺免疫抗原，具有式e所示结构，该免疫抗原免疫宿主后得到的杂交瘤细胞株mxa 9c3，能够分泌识别咪鲜胺及其代谢物的广谱特异性单克隆抗体；该单克隆抗体对咪鲜胺母体及其代谢物具有较好的特异性和检测灵敏度。因此，将本发明提供的咪鲜胺包被抗原、免疫抗原、杂交瘤细胞株或抗体应用检测产品中，有利于建立咪鲜胺母体及其代谢物免疫学检测方法，实现咪鲜胺母体及其代谢物的精确检测，特异性强且灵明度高。

28、生物材料保藏

29、杂交瘤细胞株mxa 9c3，分类命名为：小鼠杂交瘤细胞株，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：cgmcc no.45936，保藏日期为：2024年06月04日。

技术特征：

1.一种咪鲜胺包被半抗原，其特征在于，具有式b所示结构：

2.权利要求1所述的咪鲜胺包被半抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.一种咪鲜胺包被抗原，由权利要求1所述的咪鲜胺包被半抗原或权利要求2所述制备方法制备得到的咪鲜胺包被半抗原与载体蛋白偶联得到；所述咪鲜胺包被抗原具有式f所示结构：

4.一种咪鲜胺免疫抗原，其特征在于，具有式e所示结构：

5.一株杂交瘤细胞株mxa 9c3，其特征在于，其保藏号为cgmccno.45936；

6.一种抗体，其特征在于，由权利要求5所述的杂交瘤细胞株mxa 9c3分泌产生。

7.一种检测产品，其特征在于，所述检测产品中包括权利要求1所述的咪鲜胺包被半抗原，或权利要求2所述制备方法得到的咪鲜胺包被半抗原，或权利要求3所述的咪鲜胺包被抗原，或权利要求4所述的咪鲜胺免疫抗原，或权利要求5所述的杂交瘤细胞株mxa 9c3，或权利要求6所述的抗体。

8.根据权利要求7所述的检测产品，其特征在于，所述产品包括试剂、试剂盒和胶体金试纸条中的一种或多种。

9.权利要求1所述的咪鲜胺包被半抗原，或权利要求2所述制备方法得到的咪鲜胺包被半抗原，或权利要求3所述的咪鲜胺包被抗原，或权利要求4所述的咪鲜胺免疫抗原，或权利要求5所述的杂交瘤细胞株mxa 9c3，或权利要求6所述的抗体，或权利要求7或8所述的检测产品在检测咪鲜胺及其代谢物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述代谢物包括代谢bts44595和/或代谢物bts44596。

技术总结
本发明涉及免疫检测技术领域，具体涉及一种咪鲜胺包被抗原、免疫抗原以及单克隆抗体和应用。本发明通过免疫抗原免疫宿主得到的杂交瘤细胞株MXA9C3，能够分泌识别咪鲜胺及其代谢物BTS44595和BTS44596的广谱特异性单克隆抗体，且本发明提供的包被抗原能够提升抗体的灵敏度。因此，该单克隆抗体对咪鲜胺母体及其代谢物具有较高的特异性和检测灵敏度，对于咪鲜胺、BTS44595、BTS44596的IC50值分别为8.075、10.820、15.065ng/mL，且与其他相似农药小分子之间无交叉反应，有利于建立精准的咪鲜胺母体及其代谢物免疫学检测方法。

技术研发人员：金茂俊,赵云,李培培,王静,曹振,金芬,郑鹭飞,王珊珊,邵华,王淼,佘永新
受保护的技术使用者：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/12/2