检测盖塔病毒的MIRA-LFD引物组及其应用

本发明涉及生物，具体涉及检测猪盖塔病毒的mira-lfd引物组，检测方法及其应用。

背景技术：

1、盖塔病毒(getahvirus，getv)是一种rna病毒属披盖病毒科(togaviridae)甲病毒属(alphavirus)成员。主要以蚊虫为传播媒介，在人类、马、牛、猪等许多哺乳动物体内也发现了该病毒。getv可在各种脊椎动物和节肢动物体内增殖。被getv感染的病猪表现为精神不振、食欲减退或消失、全身震颤、体温升高、腹泻、体表发红、共济失调等，严重者还可出现神经症状，甚至衰竭死亡。目前尚无有效针对getv的疫苗。

2、getv与诸多能够引起猪腹泻和繁殖障碍的相关疾病有着相似的临床特征，难以区分，并且多为混合感染，使得getv的检测和诊断的难度大大增加。目前getv的检测主要是血清学方法和分子生物学方法。传统血清学检测方法阳性检出率低、操作复杂，pcr和荧光定量pcr等分子检测方法耗时较长，对技术人员要求较高且容易受到仪器的限制。

3、因此，开发一种简单快速、高特异性和灵敏度的快速病原检测方法对于实现基层病原getv检测至关重要。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中存在的上述技术问题之一，本发明提供了一种基于mira-lfd的检测盖塔病毒的引物组，试剂盒和检测方法。

2、本公开中将多酶恒温扩增技术(mira)与侧向流动免疫技术(lfd)相结合，具有判断结果肉眼可判读，检测方便，便于携带等优点。而且，利用多酶恒温扩增检测技术在常温下对病原体核酸进行扩增检测，与侧流层析试纸条结合，不需要复杂的操作以及仪器，可以做到现场快速检测。弥补了常规pcr技术操作复杂、耗时长、对仪器要求较高等缺点，从而建立了一种准确直观、便于基层及现场的快速检测方法。

3、根据本公开的一个方面，提供了一种基于mira-lfd的检测盖塔病毒的引物组，其包括：

4、正向引物：5’-ccctgacgaccaagcaaaatggtaaagcac-3’(seq id no:9)；和

5、反向引物：5’-attgtgaacctgccaccgctgtactgcact-3’(seq id no:4)。

6、在一些实施方式中，所述正向引物和/或反向引物的5’端可以带有生物素标记。

7、根据本公开的另一方面，提供了基于mira-lfd的检测盖塔病毒的试剂盒，其包括本公开的上述引物组。

8、在一些实施方式中，所述试剂盒还包括探针，所述探针优选具有5’-atgtgcactggtatctgggcgcactccaggtcatacttgctcgatttct-3’(seq id no:13)所示的核苷酸序列。

9、在一些实施方式中，所述探针可以标记有四氢呋喃、荧光基团和/或猝灭基团。

10、在一些实施方式中，所述荧光基团可以选自荧光素(fam)、菁染料、cal fluortm染料、rox染料标记等。

11、在本公开中，所述荧光基团和/或猝灭基团并没有特别的限制，可以使用本领域技术人员常规使用的任意的荧光基团和/或猝灭基团。

12、在一些实施方式中，所述荧光基团可以选自6-fam、fam-dt、ned、cy2、dy-495、atto495、cy3、vic、cal fluor 560、cal fluor gold 540、sima、texas red、tamra、cy5、6-joe和6-rox中的任一种或多种。

13、在一些实施方式中，所述猝灭基团可以选自bhq1、bhq2、bhq3、tamra(四甲基罗丹明)、dabcyl、eclipse和mgb中的任一种或多种。

14、在一些实施方式中，所述探针的3’端还可以带有阻断基团。在本公开中，所述阻断基团没有特别的限制，可以使用本领域技术人员常规使用的任意的阻断基团。

15、在一些实施方式中，所述阻断基团可以选自胺基、磷酸基团、生物素和间臂(例如c3-spacer)中的任意一种或多种。

16、在一些实施方式中，所述试剂盒还可以包括mira扩增试剂。在一些实施方式中，所述mira扩增试剂可以包括重组酶、单链dna结合蛋白、dna聚合酶、重组酶辅助蛋白和解旋酶。

17、在一些实施方式中，所述试剂盒还可以包括胶体金试纸条。

18、在一些实施方式中，所述胶体金试纸条可以包括支撑物以及依次搭接在所述支撑物上的样本垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水纸。

19、在一些实施方式中，所述金标垫上涂覆有胶体金和抗所述荧光基团的第一抗体。在一些实施方式中，所述胶体金试纸条设置有质控线和检测线，其中所述质控线包被有链霉亲和素，所述检测线包被有特异性结合所述第一抗体的第二抗体。

20、根据本公开的又一方面，提供了一种检测盖塔病毒的方法，所述方法采用本公开的上述引物组或本公开的上述试剂盒。

21、在一些实施方式中，所述方法包括恒温扩增的步骤。

22、在一些实施方式中，所述恒温扩增可以在25℃～45℃的条件下进行。在一些实施方式中，所述恒温扩增可以在25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃或45℃下进行。

23、在一些实施方式中，所述恒温扩增可以进行5～30min，优选进行5～20min。在一些实施方式中，所述恒温扩增可以进行5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min或20min。

24、根据本公开的又一方面，本公开的上述引物组、本公开的上述试剂盒或本公开的上述方法在检测样本中的盖塔病毒中的用途。

25、在一些实施方式中，所述盖塔病毒可以包括猪源盖塔病毒、牛源盖塔病毒或马源盖塔病毒。在具体的实施方式中，所述盖塔病毒可以为猪源盖塔病毒。

26、在一些实施方式中，所述样本没有特别的限制，可以为任意常规采用的样本的形式。在一些实施方式中，所述样本可以选自血液、血浆、组织样本、唾液、尿液等。

27、本公开的引物组、试剂盒或方法能够高特异性的检测盖塔病毒，而且具有高的检测灵敏度，具有低至约102拷贝/μl的检测限，且检测时间短。

28、本公开的检测方法不需要专业的实验室设备和人员，耗时短，操作简单，结果可实现肉眼可视化，可以用于盖塔病毒的现场检测，便于基层养殖场使用。更为盖塔病毒的快速诊断、实时监测防控提供技术支持。

1.一种基于mira-lfd的检测盖塔病毒的引物组，其特征在于，所述引物组包括：

2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述正向引物和/或反向引物的5’端带有生物素标记。

3.一种基于mira-lfd的检测盖塔病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的引物组。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括探针，所述探针优选具有5’-atgtgcactggtatctgggcgcactccaggtcatacttgctcgatttct-3’(seq id no:13)所示的核苷酸序列，

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括mira扩增试剂，

6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括胶体金试纸条，

7.一种检测盖塔病毒的方法，其特征在于，所述方法采用权利要求1或2所述的引物组或权利要求3至6中任一项所述的试剂盒进行检测。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括恒温扩增的步骤，

9.权利要求1或2所述的引物组或权利要求3至6中任一项所述的试剂盒在检测盖塔病毒中的用途。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述盖塔病毒包括猪源盖塔病毒、牛源盖塔病毒或马源盖塔病毒，优选为猪源盖塔病毒。