PEX16基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法

本发明涉及基因工程，特别是涉及pex16基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法。

背景技术：

1、黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumber green mottle mosaic virus,cgmmv)属帚状病毒科(virgaviridae)烟草花叶病毒属(tobamovirus)，可以侵染黄瓜、葫芦、甜瓜、西瓜等葫芦科作物，造成植株生长迟缓、叶片褪绿斑驳、果实变色和纤维化，导致严重损失，是我国重要的植物检疫性有害生物。

2、目前，cgmmv防控工作是葫芦科作物上的世界性难题，没有有效的化学药剂可防治cgmmv。通过传统的方法可以在一定程度上减轻cgmmv的危害，如使用种子消毒、通过改进栽培技术培育健壮植株、田间及时铲除发病单株、使用抗病品种，利用杀虫剂切断病毒的传播载体等。但是现阶段仍未有针对cgmmv有防治效果的药剂被开发出来，且已有研究表明种子处理措施效率不高且不稳定，影响种子萌发率。另外，嫁接技术一直以来是葫芦科作物在生产中普遍应用的农事操作技术，也是防治病虫害的有力措施之一，然而一些研究表明cgmmv可从西瓜砧木中运输到其接穗中，从而使得cgmmv通过嫁接传播而潜在地成为田间的初侵染来源。尽管不同寄主的抗性信号以及病原侵染机制存在多样性和复杂性，但基于内源基因和外源基因通过转基因介导的培育抗性植株仍是最有效的途径之一。

3、由于现阶段还没有开发出有效抑制植物病毒侵染的农药，因此通过抗性相关基因的表达或者感病基因的敲除实现作物对病毒的抗性具有重要的的应用前景。鉴于植物病毒需要依赖大量的寄主因子进行繁殖，因此利用寄主中的植物病毒所需要的关键感病因子进行抗病毒是最好的防治方法之一。过氧化物酶体可以通过与线粒体、内质网、溶酶体和脂滴等其他细胞器或细胞内容物直接的相互作用来进行交流和维持功能。过氧化物酶体在分解代谢和合成代谢途径中可以为不同的细胞提供不同的生理生化反应，并且可以通过对过氧化物酶体自身形态的调控和与其相关代谢的改变以响应外部刺激植物过氧化物酶体在植物病毒的复制和繁殖中发挥着重要作用，并且不同的植物病毒为了侵染而调节过氧化物酶体的代谢和形态。

4、本发明研究发现过氧化物酶体相关基因pex16参与cgmmv的复制与致病，但是pex16不是植物所必需的基因，表明pex16是一个可以操控的重要植物感病基因。因此，基于此机理，通过基因编辑的方式敲除植物中的pex16从而实现对cgmmv有效的抗性具有重要价值。

技术实现思路

1、本发明的第一目的是提供一种pex16基因在调控植物抗病毒中的应用。

2、本发明的第二目的是提供一种pex16基因敲除的转基因植物的培育方法。

3、本发明利用植物免疫反应中的抗病反应原理，发现了本氏烟中alkbh9b基因是一个感病基因。通过农杆菌转化的方法，将携带alkbh9b靶点的crispr载体导入目的植物中，获得的本氏烟alkbh9b基因敲除植物能够显著减轻tumv的侵染，有效控制该病毒的危害。

4、为实现上述目的，本发明采用的技术方案具体如下：

5、pex16基因在调控植物抗病毒中的应用，其中，所述病毒为黄瓜绿斑驳花叶病毒，所述植物为本氏烟；所述pex16基因的转录本序列如seq id no:1所示，将pex16基因突变抵御黄瓜绿斑驳花叶病毒的侵染。

6、一种抗黄瓜绿斑驳花叶病毒的pex16转基因植物的培育方法，通过crispr/cas9技术获得的本氏烟敲除pex16转基因植株。

7、具体包括以下步骤：

8、(1)通过crispr/cas9编辑位点预测网站https://crispr.cos.uni-heidelberg.de/分析pex16中潜在的crispr/cas9编辑位点，选择出靶标位点序列t24和t29，序列如seq id no：8-9所示，构建载体的引物cas-pex16-t24-f、cas-pex16-t24-r、cas-pex16-t29-f、cas-pex16-t29-r；引物序列如seq id no：2-5所示；

9、cas-pex16-t24-f：tgattgtcggaattcatgtccaaatg

10、cas-pex16-t24-r：aaaccatttggacatgaattccgaca

11、cas-pex16-t29-f：tgattgatcagcagttgaagacaagt

12、cas-pex16-t29-r：aaacacttgtcttcaactgctgatca；

13、(2)将cas-pex16-t24/t29合成双链后通过酶切连接构建到含有35s启动子表达cas9的crispr载体上，得到cas-pex16载体；

14、(3)将cas-pex16载体转入农杆菌后侵染烟草进行烟草的遗传转化，获得pex16基因突变体植物t0代，用ctab法提取突变体植株叶片dna；

15、(4)以提取的dna模板进行pcr扩增测序，确定突变体的突变情况；采用的检测引物序列如seq id no.6-7所示；

16、pex16-detect-f：atgcataggagccaactattgattctt

17、pex16-detect-r：ggaagaagagtctaagtcttgctgctg；

18、(5)将鉴定到的纯合突变体留种，与野生型本氏烟一起播种，播种20天后，接种cgmmv，观察病毒症状并分析病毒积累量。

19、同现有技术相比，本发明的突出效果在于：

20、本发明发现了植物寄主因子pex16突变体能够显著抑制黄瓜绿斑驳花叶病毒cgmmv的侵染，对cgmmv的防控具有重要意义，也为病毒防控事业提供了借鉴意义。

21、本发明成功在本氏烟中敲除pex16，并发现敲除此基因后植株获得了抗黄瓜绿斑驳花叶病毒的功能。通过crispr/cas9技术，获得的本氏烟敲除pex16转基因植株经鉴定可阻碍黄瓜绿斑驳花叶病毒的侵染，具有重要的生产意义。

22、下面结合附图说明和具体实施例对本发明所述的pex16基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法作进一步说明。

技术特征：

1.pex16基因在调控植物抗病毒中的应用，其特征在于：所述病毒为黄瓜绿斑驳花叶病毒，所述植物为本氏烟；所述pex16基因的转录本序列如seq id no:1所示，将pex16基因突变抵御黄瓜绿斑驳花叶病毒的侵染。

2.根据权利要求1所述的pex16基因在调控植物抗病毒中的应用，其特征在于：通过crispr/cas9技术获得的本氏烟敲除pex16转基因植株抑制黄瓜绿斑驳花叶病毒的侵染。

3.一种抗黄瓜绿斑驳花叶病毒的pex16转基因植物的培育方法，其特征在于：通过crispr/cas9技术获得的本氏烟敲除pex16转基因植株。

4.根据权利要求3所述的pex16转基因植物的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的pex16转基因植物的培育方法，其特征在于：所述步骤(1)中的引物序列如seq id no：2-5所示；

6.根据权利要求5所述的pex16转基因植物的培育方法，其特征在于：所述步骤(4)中，采用的检测引物序列如seq id no.6-7所示；

技术总结
本发明公开了一种PEX16基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法，所述病毒为黄瓜绿斑驳花叶病毒，PEX16基因的转录本序列如SEQ ID NO:1所示；所述植物为本氏烟。本发明通过CRISPR/Cas9技术将PEX16基因进行突变获得的本氏烟pex16基因突变体植株能够显著抑制黄瓜绿斑驳花叶病毒的侵染。

技术研发人员：李方方,陈雅琳,周雪平
受保护的技术使用者：中国农业科学院植物保护研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/10/17