一种制备二酯油的脂肪酶的制备方法与流程

本发明涉及化工，具体是一种制备二酯油的脂肪酶的制备方法。

背景技术：

1、酶法催化甘油解反应由于体系中原料简单易获得，反应条件温和、环境污染小而被优先选择用于甘油二酯的制备。传统的酶法催化甘油解反应，由于固定化酶的购买成本高，反应体系中需要添加过量甘油，存在底物粘度大、反应不充分、反应缓慢等问题，对于工业化生产不利，本发明采用自制固定化酶进行甘油解反应以降低酶的成本，得到高二酯含量的粗制二酯油，进一步纯化得到纯二酯油。酶解反应得到的二酯油中含有较多脂肪酸及单甘酯，目前工业化生产上采用的二酯油纯化工艺为分子蒸馏，该工艺所需设备成本高、能耗高、纯化速率低，使得二酯油产量极低且售价昂贵，本发明提供一种适用于工业化生产的二酯油纯化方法，可大大降低生产成本，提高纯化效率。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种制备二酯油的脂肪酶的制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

2、本发明的技术方案如下：

3、一种制备二酯油的脂肪酶的制备方法，包括如下步骤：

4、步骤(1)制备脂肪酶液：脂肪酶菌株的高密度发酵；

5、步骤(2)制备固定化脂肪酶：高密度发酵得到的脂肪酶液与树脂载体混合，在摇床中加热吸附，固定一定时间，纯水清洗过滤后干燥后得到固定化脂肪酶；

6、步骤(3)催化反应：食用油、甘油、固定化脂肪酶混合，加热反应一定时间以制备粗制二酯油；

7、步骤(4)乙醇多次萃取控温法纯化粗制二酯油，除去脂肪酸和甘油单酯；真空干燥除去乙醇和水分，得到甘油二酯含量高的二酯油。

8、所述步骤(1)所述的脂肪酶菌株，其脂肪酶序列来源于南极假丝酵母脂肪酶b，表达菌株为毕赤酵母。

9、所述步骤(2)所述树脂载体包括大孔吸附树脂、环氧树脂、离子交换树脂中的一种。

10、所述步骤(2)所述树脂在固定化前需活化，步骤为95％乙醇溶液浸泡24h(高于树脂2～3cm)，纯水清洗数次至无酒精气味后过滤；再用5％盐酸溶液浸泡4h(高于树脂2～3cm)，纯水清洗数次至滤液呈中性；再用5％氢氧化钠溶液浸泡4h(高于树脂2～3cm)，纯水清洗数次至滤液呈中性；pbs ph 7.0溶液浸泡4h(高于树脂2～3cm)，pbs ph 7.0溶液浸泡清洗数次至滤液呈中性，放置4℃冰箱备用。

11、所述步骤(2)所述固定化体系中酶液浓度为4～10mg/ml，优选为8mg/ml；酶液体积为50ml；所述固定化体系中活化湿树脂加入量为1～4g，优选为2g；所述摇床温度设定为20～30℃，优选为25℃；转速设定为150～220rpm，优选为180rpm；所述固定时间为2～12h，优选为4h；所述干燥温度为20～40℃，优选为30℃。

12、所述步骤(3)所述食用油为甘油三酯，优选为棕榈油；添加的棕榈油与甘油摩尔比为1～3：1，优选为2：1；添加的固定化脂肪酶与棕榈油的质量比为2％-5％，优选为4％；反应温度设定为40～80℃，优选为60℃；反应时间为4～12h，优选为6h。

13、所述步骤(4)所述乙醇浓度为60％～70％，优选为70％；所述乙醇与粗制二酯油质量比为5～1：1，优选为3：1；所述温度为40～60℃，优选为50℃；所述萃取次数为1～5次，优选为3次。

14、所述步骤(4)所述每次萃取过程中，需搅拌混合5～20min，优选为10min；两相静置分层时间为5～20min，优选为10min。

15、所述步骤(4)步骤(4)所述真空干燥温度为50～60℃，优选为55℃；干燥时间为30min-2h，优选为1h；制备得到的二酯油中甘油二酯含量达50％以上，同时单酯含量小于1.5％。

16、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

17、本发明通过以范德华力、氢键、疏水性互作用等弱相互作用为主的物理吸附法将脂肪酶固定于载体上，制备得到的固定化脂肪酶使得酶蛋白活性中心不易被破坏，增加酶的稳定性；制作方法简单，成本低廉；载体可反复多次使用，大大降低了生产成本。

18、本发明提出乙醇萃取法对粗制二酯油进行纯化。传统的分子蒸馏法，由于高温环境会导致缩水甘油酯的产生，缩水甘油酯食用后在人体内会分解为有害的缩水甘油，因此后期还需增加去除缩水甘油酯的工艺；分子蒸馏设备价格昂贵，能耗高，进料速度及体积有限，使得纯化成本极高且二酯油产量低。本发明采用的乙醇萃取法中，乙醇为友好溶剂，获取方式简单且可通过旋蒸回收利用；萃取塔设备操作简单，价格相比于分子蒸馏设备价格更便宜；整个纯化过程温度均处于低温状态，避免了缩水甘油酯等有害物质生成。

技术特征：

1.一种制备二酯油的脂肪酶的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的制备二酯油的脂肪酶单位制备方法，其特征在于所述步骤(1)所述的脂肪酶菌株，其脂肪酶序列来源于南极假丝酵母脂肪酶b，表达菌株为毕赤酵母。

3.根据权利要求1所述的制备二酯油的脂肪酶单位制备方法，其特征在于所述步骤(2)所述树脂载体包括大孔吸附树脂、环氧树脂、离子交换树脂中的一种。

4.根据权利要求1所述的制备二酯油的脂肪酶单位制备方法，其特征在于所述步骤(2)所述树脂在固定化前需活化，步骤为95％乙醇溶液浸泡24h(高于树脂2～3cm)，纯水清洗数次至无酒精气味后过滤；再用5％盐酸溶液浸泡4h(高于树脂2～3cm)，纯水清洗数次至滤液呈中性；再用5％氢氧化钠溶液浸泡4h(高于树脂2～3cm)，纯水清洗数次至滤液呈中性；pbsph7.0溶液浸泡4h(高于树脂2～3cm)，pbs ph 7.0溶液浸泡清洗数次至滤液呈中性，放置4℃冰箱备用。

5.根据权利要求1所述的制备二酯油的脂肪酶单位制备方法，其特征在于所述步骤(2)所述固定化体系中酶液浓度为4～10mg/ml，优选为8mg/ml；酶液体积为50ml；所述固定化体系中活化湿树脂加入量为1～4g，优选为2g；所述摇床温度设定为20～30℃，优选为25℃；转速设定为150～220rpm，优选为180rpm；所述固定时间为2～12h，优选为4h；所述干燥温度为20～40℃，优选为30℃。

6.根据权利要求1所述的制备二酯油的脂肪酶单位制备方法，其特征在于所述步骤(3)所述食用油为甘油三酯，优选为棕榈油；添加的棕榈油与甘油摩尔比为1～3：1，优选为2：1；添加的固定化脂肪酶与棕榈油的质量比为2％-5％，优选为4％；反应温度设定为40～80℃，优选为60℃；反应时间为4～12h，优选为6h。

7.根据权利要求1所述的制备二酯油的脂肪酶单位制备方法，其特征在于所述步骤(4)所述乙醇浓度为60％～80％，优选为70％；所述乙醇与粗制二酯油质量比为5～1：1，优选为3：1；所述温度为40～60℃，优选为50℃；所述萃取次数为1～5次，优选为3次。

8.根据权利要求1所述的制备二酯油的脂肪酶单位制备方法，其特征在于所述步骤(4)所述每次萃取过程中，需搅拌混合5～20min，优选为10min；两相静置分层时间为5～20min，优选为10min。

9.根据权利要求1所述的制备二酯油的脂肪酶单位制备方法，其特征在于所述步骤(4)步骤(4)所述真空干燥温度为50～60℃，优选为55℃；干燥时间为30min-2h，优选为1h；制备得到的二酯油中甘油二酯含量达50％以上，同时单酯含量小于1.5％。

技术总结
一种制备二酯油的脂肪酶的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)制备脂肪酶液：脂肪酶菌株的高密度发酵；(2)制备固定化脂肪酶：高密度发酵得到的脂肪酶液与树脂载体混合，在摇床中加热吸附，固定一定时间，纯水清洗过滤后干燥后得到固定化脂肪酶；(3)催化反应：食用油、甘油、固定化脂肪酶混合，加热反应一定时间以制备粗制二酯油；(4)乙醇多次萃取控温法纯化粗制二酯油，除去脂肪酸和甘油单酯；真空干燥除去乙醇和水分，得到甘油二酯含量高的二酯油。本发明通过自制固定化脂肪酶提高酶的稳定性和使用次数，提出了一种全新的纯化方法，即乙醇萃取法来纯化甘油二酯油。此方法相比传统的分子蒸馏法效率更高，主要表现在纯化设备简单易获得、全程低温条件、单次纯化物料量大、萃取时间短等优势。

技术研发人员：系祖斌,李明磊,姚立成,梅倩云,李一佳,曹许昊珺
受保护的技术使用者：上海同合万康生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/12/30