一种人工染色体及其构建方法和应用

本公开涉及生物，尤其涉及一种人工染色体及其构建方法和应用。

背景技术：

1、酵母人工染色体是一种存在于酵母细胞内，能够克隆长达几百kb的dna片段的载体，含有酵母细胞中必需的端粒、着丝点和复制起始序列，是细胞内具有遗传性质的物体。在合成生物学中，酵母人工染色体主要用来构建大片段dna文库，特别用来构建高等真核生物的基因组文库，并不用作常规的基因克隆。

2、大片段dna的合成是实现生物体完整基因组合成的关键步骤，dna片段在生物体内稳定存在和增殖是必要条件。利用酵母人工染色体合成目标大片段dna，是将dna片段引入微生物细胞内，并连接到酵母人工染色体的指定部位。dna合成技术是合成生物学的关键技术。近年来，随着dna测序技术和dna合成技术的快速发展，应用工程学手段对基因、生物元件、代谢途径甚至基因组进行设计与合成的新兴学科合成生物的迅速发展，dna合成技术的作用愈发凸显。传统的小片段合成及基因操作虽然仍在很多方面发挥着重要作用，但在设计操纵单元越来越大的趋势下已不能满足需求。

3、目前，人类已开始尝试合成较大基因组的微生物，甚至是哺乳动物的基因组。合成基因组的尺度巨大，而常规的载体已无法装载如此大尺度的基因组，更不用说高效的完成组装过程。因此，为满足大尺度的dna组装需求，必须开发一种相应的载体，以实现高效、稳定的基因组组装。

技术实现思路

1、本公开提供了一种人工染色体及其构建方法和应用，以至少解决现有技术中存在的以上技术问题。

2、根据本公开的第一方面，提供了一种人工染色体pcu，包括初始人工染色体，以及与所述初始人工染色体连接的功能基因；所述功能基因包括cas9基因、营养缺陷型筛选标记基因、grna识别序列、同源序列1和片段同源序列。

3、在一可实施方式中，所述功能基因的核酸序列如seq id no:1所示。

4、具体地，所述功能基因的核酸序列全长为6295bp，其中，1-1180bp为所述片段同源序列，1181-5280bp为所述cas9基因，5281-6179bp为所述营养缺陷型筛选标记基因，6201-6244bp为所述grna识别序列，6245-6295bp为所述同源序列1。

5、在一可实施方式中，所述营养缺陷型筛选标记基因为ura筛选标记基因。

6、在一可实施方式中，所述初始人工染色体为pcci-2μ。

7、在一可实施方式中，所述初始人工染色体与所述功能基因的连接方式为gibson连接。

8、根据本公开的第二方面，提供了上述人工染色体pcu的构建方法，包括以下步骤：将功能基因通过酶切和酶连的方式连接到初始人工染色体上；然后将连接产物转化至大肠杆菌中，并在氯霉素抗性平板上挑取阳性克隆，即得所述人工染色体pcu。

9、在一可实施方式中，所述功能基因通过酶切和酶连的方式连接到所述初始人工染色体的bamhⅰ酶切切点后的位点处。

10、在一可实施方式中，将所述连接产物转化至所述大肠杆菌中后，将转化后的大肠杆菌涂布于所述氯霉素抗性平板上培养，然后再挑取所述阳性克隆。

11、根据本公开的第三方面，提供了利用上述人工染色体pcu进行dna大片段胞内组装的方法，包括以下步骤：将所述人工染色体pcu和待组装的dna大片段导入酵母细胞中，通过胞内同源重组，完成组装。

12、在一可实施方式中，所述待组装的dna大片段的长度为100～800kb。

13、在一优选的实施方式中，所述待组装的dna大片段的长度为200kb。

14、在一优选的实施方式中，所述待组装的dna大片段由20个10kb的dna片段在胞内组装而成；相邻的两个所述dna片段中，前一个所述dna片段的3’端与后一个所述dna片段的5’端均含有300～700bp的相同序列，确保其在胞内能进行高效的同源重组。

15、在一可实施方式中，所述人工染色体pcu的同源序列1与所述待组装的dna大片段的n-端和c-端中任一端的部分序列同源，所述人工染色体pcu的片段同源序列与所述待组装的dna大片段的n-端和c-端中另一端的部分序列同源。

16、具体地，若人工染色体pcu的同源序列1与待组装的dna大片段的n-端的部分序列同源，则人工染色体pcu的片段同源序列与待组装的dna大片段的c-端的部分序列同源；反之，若同源序列1与待组装的dna大片段的c-端的部分序列同源，则片段同源序列与待组装的dna大片段的n-端的部分序列同源。

17、在一可实施方式中，通过醋酸锂转化法将所述人工染色体pcu和所述待组装的dna大片段导入所述酵母细胞中。

18、根据本公开的第四方面，提供了上述人工染色体pcu在基因克隆、dna合成中的应用。

19、根据本公开的一种可实施方式，至少具有以下有益效果：

20、本公开通过对人工染色体进行设计和改造，借助酵母细胞内的高效同源重组能力实现了大片段dna在胞内的一次组装，提高了大片段dna的合成效率，避免了体外操作易断裂，效率较低的问题，为后续更大尺度完整基因组的合成提供了工具。

21、应当理解，本部分所描述的内容并非旨在标识本公开的实施例的关键或重要特征，也不用于限制本公开的范围。本公开的其它特征将通过以下的说明书而变得容易理解。

技术特征：

1.一种人工染色体pcu，其特征在于，所述人工染色体pcu包括初始人工染色体，以及与所述初始人工染色体连接的功能基因；所述功能基因包括cas9基因、营养缺陷型筛选标记基因、grna识别序列、同源序列1和片段同源序列。

2.根据权利要求1所述的人工染色体pcu，其特征在于，所述营养缺陷型筛选标记基因为ura筛选标记基因；

3.根据权利要求1所述的人工染色体pcu，其特征在于，所述功能基因的核酸序列如seqid no:1所示；所述功能基因的核酸序列全长为6295bp，其中，1-1180bp为所述片段同源序列，1181-5280bp为所述cas9基因，5281-6179bp为所述营养缺陷型筛选标记基因，6201-6244bp为所述grna识别序列，6245-6295bp为所述同源序列1。

4.权利要求1～3任一项所述人工染色体pcu的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将功能基因通过酶切和酶连的方式连接到初始人工染色体上；然后将连接产物转化至大肠杆菌中，并在氯霉素抗性平板上挑取阳性克隆，即得所述人工染色体pcu。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述功能基因通过酶切和酶连的方式连接到所述初始人工染色体的bamhⅰ酶切位点后的位点处。

6.利用权利要求1～3任一项所述人工染色体pcu进行dna大片段胞内组装的方法，其特征在于，包括以下步骤：将所述人工染色体pcu和待组装的dna大片段导入酵母细胞中，通过胞内同源重组，完成组装。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述待组装的dna大片段的长度为100～800kb。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述人工染色体pcu的同源序列1与所述待组装的dna大片段的n-端和c-端中任一端的部分序列同源，所述人工染色体pcu的片段同源序列与所述待组装的dna大片段的n-端和c-端中另一端的部分序列同源。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，通过醋酸锂转化法将所述人工染色体pcu和所述待组装的dna大片段导入所述酵母细胞中。

10.权利要求1～3任一项所述人工染色体pcu在基因克隆、dna合成中的应用。

技术总结
本公开属于生物技术领域，提供了一种人工染色体及其构建方法和应用。人工染色体包括连接的初始人工染色体和功能基因；功能基因包括Cas9基因、Ura筛选标记基因、gRNA识别序列、同源序列1和片段同源序列。构建方法：将功能基因通过酶切酶连的方式连接到初始人工染色体上；将连接产物转化至大肠杆菌中，并在氯霉素抗性平板上挑取阳性克隆。DNA大片段胞内组装：将上述人工染色体和待组装的DNA大片段导入酵母细胞中，通过胞内同源重组完成组装。还公开了上述人工染色体在基因克隆、DNA合成中的应用。本公开的人工染色体可提高大片段DNA合成效率，避免了体外操作易断裂，效率低的问题，为后续完整基因组的合成提供了工具。

技术研发人员：仰大勇,姚池,谭维,贾雪梅,李帅
受保护的技术使用者：天津大学
技术研发日：
技术公布日：2024/12/30