防御假单胞菌FD6rpoS突变株抗肿瘤发酵产物的制备及其应用

本发明属于微生物药学领域，具体涉及防御假单胞菌(pseudomonas protegens)fd6 rpos突变株抗肿瘤发酵产物的制备及其应用。

背景技术：

1、假单胞菌属(pseudomonas)细菌能够产生丰富的次生代谢产物，其中一些具有良好抗菌活性的化合物已被商品化而广泛用于临床和农业领域，如：硝吡咯菌素(pyrrolnitrin，prn)、莫匹罗星(mupirocin)等。防御假单胞菌(pseudomonas protegens)fd6是从福建省闽侯青口青菜根际分离获得的一株细菌，全基因组测序显示，其基因组存在17个生物合成基因簇，涉及2,4-二乙酰基间苯三酚(2,4-diacetylphloroglucinol，2,4-dapg)、藤黄绿脓菌素(pyoluteorin，plt)、硝吡咯菌素(pyrrolnitrin，prn)等次生代谢产物的生物合成。目前已发现，p.protegens fd6能产生2,4-二乙酰基间苯三酚、硝吡咯菌素、藤黄绿脓菌素、氢氰酸以及环脂肽orfamide a等抗菌活性成分，还能产生aerugine、salicylamide、cyclo-(cis-l-phe-d-4-oh-pro)、cyclo(gly-pro)、cyclo-(l-ala-l-4-oh-pro)等化学成分。

2、rpos基因编码的rpos蛋白是一类非必需sigma因子，其可以调节次生代谢产物的合成，且在不同菌株中调控方式不同。p.fluorescens pf-5的rpos基因突变株硝吡咯菌素(prn)产量下降、但2,4-二乙酰基间苯三酚(2,4-dapg)和藤黄绿脓菌素(plt)的产量提高；而p.chlororaphis o6的rpos基因缺失突变后，其氢氰酸产量减少，而吩嗪类化合物产量增加。研究已发现，与fd6野生型菌株相比，fd6 rpos基因缺失突变株的2,4-二乙酰基间苯三酚(2,4-dapg)和藤黄绿脓菌素(plt)的产量显著增加，分别增加约25倍和30倍。fd6中rpos基因负调控抗菌活性成分2,4-dapg和plt的生物合成，但对其它化学成分的生物合成影响有待研究。

技术实现思路

1、本发明提供一种p.protegens fd6 rpos突变株发酵液粗浸膏，其特征在于由如下方法制备：

2、(1)将p.protegens fd6 rpos突变株单菌落接种于lb培养基中于28℃、180rpm条件下培养24h得种子液，备用；

3、(2)将步骤(1)得到的种子液按1‰的接种量接种到添加不同碳源的tsb基础培养基中，室温至30℃下培养36-60h，得发酵液；

4、(3)将步骤(2)得到的发酵液于4℃、9000-10000rpm离心10-15min，收集上清液，用乙酸乙酯萃取2-3次，减压浓缩即得所述p.protegens fd6 rpos突变株发酵液粗浸膏。

5、所述tsb基础培养基的配方为每升水使用胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，nacl 5g，ph＝7.0～7.2。碳源选自蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、甘油、柠檬酸钠中的一种，碳源的用量为基础培养基质量的2％-3％。碳源优选麦芽糖、甘油。

6、所述p.protegens fd6 rpos突变株发酵液粗浸膏的产量为蔗糖培养基176.9±9.6mg/l，乳糖培养基209.7±8.5mg/l，麦芽糖培养基271.2±2.3mg/l，葡萄糖培养基193.8±5.6mg/l，甘油培养基402.5±10.5mg/l，柠檬酸钠培养基127.1±2.3mg/l。

7、所述p.protegens fd6 rpos突变株发酵液粗浸膏的1h-nmr图基本如图3所示。

8、所述p.protegens fd6 rpos突变株发酵液粗浸膏的lc-ms图基本如图4所示。

9、本发明的另一实施方案提供上述p.protegens fd6 rpos突变株发酵液粗浸膏的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

10、(1)将p.protegens fd6 rpos突变株单菌落接种于lb培养基中于28℃、180rpm条件下培养24h得种子液，备用；

11、(2)将步骤(1)得到的种子液按1‰的接种量接种到添加不同碳源的tsb基础培养基中，室温至30℃下培养36-60h，得发酵液。

12、(3)将步骤(2)得到的发酵液于4℃、9000-10000rpm离心10-15min，收集上清液，用乙酸乙酯萃取2-3次，减压浓缩即得所述添加不同碳源的tsb基础培养基发酵液粗浸膏。

13、所述tsb基础培养基的配方为每升水使用胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，nacl 5g，ph＝7.0～7.2。碳源选自蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、甘油、柠檬酸钠中的一种，碳源的用量为基础培养基质量的2％-3％。

14、本发明的另一实施方案提供上述p.protegens fd6 rpos突变株发酵液粗浸膏在制备抗肿瘤药物中的应用。所述肿瘤优选人非小细胞肺癌细胞株a549。

15、本发明的另一实施方案提供一种组合物，其特征在于该组合物以上述p.protegens fd6rpos突变株发酵液粗浸膏作为有效成分。该组合物还可包括其他抗肿瘤药物。该组合物还可包含药学上可接受的盐。该组合物的剂型选自固体制剂、液体制剂或半固体制剂。

16、本发明所述lb培养基的配方为每升水使用酵母粉5.0g，胰蛋白胨10.0g，nacl10.0g，ph＝7.0～7.2。

17、本发明所述“p.protegens fd6 rpos突变株”是由“防御假单胞菌pseudomonasprotegens fd6”通过基因敲除获得的。“防御假单胞菌pseudomonas protegens fd6”简称“p.protegens fd6”是从福建省闽侯青口青菜根际分离获得的一株细菌，其its序列已经提交到ncbi网站，genbank号为cp031396。p.protegens fd6已在发明人的先前研究论文“australasian plant pathology,2020,49:307-317”中公开，“p.protegens fd6 rpos突变株”在发明人的先前研究论文“frontiers in microbiology,2022,13:993732”中公开，并且上述两个菌株一直保藏于申请人所在的扬州大学园艺与植物保护学院，公众可按照发明人上述研究论文中记载的方法获得p.protegens fd6和p.protegens fd6 rpos突变株，或者向申请人所在的扬州大学园艺与植物保护学院购买获得，申请人承诺自本发明申请日起20年扬州大学园艺与植物保护学院可向公众提供p.protegens fd6和p.protegens fd6rpos突变株。

技术特征：

1.一种p.protegens fd6 rpos突变株发酵液粗浸膏，其特征在于由如下方法制备：

2.权利要求1所述的粗浸膏，其特征在于所述tsb基础培养基的配方为每升水使用胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，nacl 5g，ph＝7.0～7.2。

3.权利要求1-2任一项所述的粗浸膏，其特征在于碳源选自蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、甘油、柠檬酸钠中的一种，碳源的用量为基础培养基质量的2％-3％。

4.权利要求1-3任一项所述的粗浸膏，其特征在于碳源优选麦芽糖、甘油。

5.权利要求1-4任一项所述的粗浸膏，其特征在于所述p.protegens fd6 rpos突变株发酵液粗浸膏的1h-nmr图基本如图3所示。

6.权利要求1-5任一项所述的粗浸膏，其特征在于所述p.protegens fd6 rpos突变株发酵液粗浸膏的lc-ms图基本如图4所示。

7.权利要求1-6任一项所述的粗浸膏的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

8.权利要求1-6任一项所述的粗浸膏在制备抗肿瘤药物中的应用。

9.一种组合物，其特征在于该组合物以权利要求1-6任一项所述的粗浸膏作为有效成分。

10.权利要求9所述的组合物，其特征在于还可包括其他抗肿瘤药物；该组合物还可包含药学上可接受的盐；该组合物的剂型选自固体制剂、液体制剂或半固体制剂。

技术总结
本发明属于微生物药学领域，具体涉及防御假单胞菌(Pseudomonas protegens)FD6rpoS突变株抗肿瘤发酵产物的制备及其应用。本发明基于TSB培养基进行P.protegens FD6rpoS突变株的碳源优化，结果发现，以麦芽糖和甘油为碳源时，FD6rpoS突变株的发酵液粗浸膏能显著抑制人非小细胞肺癌细胞株A549的增殖，IC<subgt;50</subgt;值分别为22.62±9.80和25.59±4.05μg/mL，在肺癌治疗方面应用前景良好。

技术研发人员：申丽,唐金晶,戴华,张清霞,谈子民,梁詠文
受保护的技术使用者：扬州大学
技术研发日：
技术公布日：2024/12/10