一种茭白ZlPDS基因VIGS沉默体系的构建方法及其产品

本发明涉及一种茭白zlpds基因vigs沉默体系的构建方法及其产品，属于生物。

背景技术：

1、茭白(zizania latifolia)是菰和菰黑粉菌互作形成的重要水生蔬菜，其味道鲜美，营养丰富，深受人民的喜爱，目前已成为我国第二大水生蔬菜。长期以来，人们一直试图探明茭白孕茭的独特机制。但是目前对茭白孕茭机理的分子生物学方面的研究还处于起步开始阶段，虽然通过多组学测序后，获得了一系列的差异蛋白或表达基因，但后续的研究仅仅处于利用qrt-pcr的方法进行简单的功能验证，由于茭白遗传转化体系尚不成熟，无法进行下一步的深入研究，严重制约了其基因功能的研究。

2、病毒介导的基因沉默技术(virus induced gene silencing，vigs)，是对植物基因功能分析和研究的一种有效手段，该技术不经过遗传转化，获得基因的沉默植株，能够快速简便的鉴定相关基因的功能。然而目前尚未见茭白基因vigs沉默体系的报道。因此亟待建立一种快速验证茭白基因功能的方法，简化操作步骤，缩短验证时间，提高验证的准确性，为研究茭白基因功能奠定了基础。

技术实现思路

1、发明目的：本发明的目的是提供了一种可有效降低茭白zlpds基因表达的沉默体系的构建方法及其产品。

2、技术方案：本发明提供了一种茭白zlpds基因vigs沉默体系的构建方法，包括如下步骤：

3、(1)将zlpds正向-fomv-int-zlpds反向特异性片段连接至线性化的pfomv质粒上，构建得到pfomv-zlpds；所述zlpds正向-fomv-int-zlpds反向异性片段的核苷酸序列如seqid no.13所示；

4、(2)将pfomv-zlpds转化至农杆菌中，利用摩擦接种法接种于茭白中心叶，至少培养20天即得。

5、进一步地，步骤(1)中所述zlpds正向-fomv-int-zlpds反向特异性片段的获得包括以下步骤：以zlpds正向特异性片段和fomv-int片段为模板，扩增得到zlpds正向-拟南芥int片段；再以zlpds正向-拟南芥int片段和zlpds反向特异性片段为模板，扩增得到zlpds正向-fomv-int-zlpds反向特异性片段；所述zlpds正向特异性片段的核苷酸序列如seq idno.3所示，fomv-int片段的核苷酸序列如seq id no.11所示，zlpds反向特异性片段的核苷酸序列如seq id no.6所示。

6、进一步地，扩增zlpds正向-拟南芥int片段所用引物的核苷酸序列如seq id no.1和seq id no.10所示；扩增zlpds正向-fomv-int-zlpds反向特异性片段所用引物的核苷酸序列如seq id no.1和seq id no.5所示。

7、进一步地，所述zlpds正向特异性片段的获得：以茭白cdna为模版扩增，所用引物的核苷酸序列如seq id no.1～2所示。

8、进一步地，所述fomv-int片段的获得：以拟南芥int片段核苷酸序列为模版，所用引物的核苷酸序列如seq id no.9～10所示。

9、进一步地，所述zlpds反向特异性片段的获得：以茭白cdna为模版扩增，所用引物的核苷酸序列如seq id no.4～5所示。

10、进一步地，步骤(2)中所述的摩擦接种法包括以下步骤：用含有pfomv-zlpds质粒的农杆菌注射烟草，培养4～6天后将烟草研磨成汁液，在茭白的中心叶的1/2处先用毛刷轻轻擦拭，然后再蘸取烟草汁液擦拭转接，2min后用清水冲洗。

11、进一步地，所述烟草的培养条件为25℃，16h/8h光/暗。

12、进一步地，用于接种的茭白为3～4叶期。

13、进一步地，茭白在接种后的培养条件为25～28℃，14h/10h光/暗周期，接种后的48h内先加湿器保持湿度90％左右，48h后正常湿度培养。

14、本发明还提供了一种根据上述构建方法构建得到的茭白zlpds基因vigs沉默体系。

15、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下突出的显著优点：本发明通过构建含有茭白zlpds基因特异性片段的狗尾草花叶病毒(fomv)介导基因沉默表达载体pfomv-pds质粒，并利用农杆菌介导法转化茭白，诱导目标基因zlpds发生沉默，有效降低了zlpds基因的表达水平，能够在茭白植株内进行持续较长时间的扩散传播，且导致叶片出现白化现象。本发明在茭白中建立了一种沉默效率高的茭白zlpds基因vigs沉默体系，可用于验证目标基因功能，克服了茭白遗传转化困难，简化操作步骤，为研究茭白基因功能奠定了基础。

技术特征：

1.一种茭白zlpds基因vigs沉默体系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的茭白zlpds基因vigs沉默体系的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述zlpds正向-fomv-int-zlpds反向特异性片段的获得包括以下步骤：以zlpds正向特异性片段和fomv-int片段为模板，扩增得到zlpds正向-拟南芥int片段；再以zlpds正向-拟南芥int片段和zlpds反向特异性片段为模板，扩增得到zlpds正向-fomv-int-zlpds反向特异性片段；所述zlpds正向特异性片段的核苷酸序列如seq id no.4所示，fomv-int片段的核苷酸序列如seq id no.12所示，zlpds反向特异性片段的核苷酸序列如seq id no.7所示。

3.根据权利要求2所述的茭白zlpds基因vigs沉默体系的构建方法，其特征在于，扩增zlpds正向-拟南芥int片段所用引物的核苷酸序列如seq id no.2和seq id no.11所示；扩增zlpds正向-fomv-int-zlpds反向特异性片段所用引物的核苷酸序列如seq id no.2和seq id no.6所示。

4.根据权利要求2所述的茭白zlpds基因vigs沉默体系的构建方法，其特征在于，所述zlpds正向特异性片段的获得：以茭白cdna为模版扩增，所用引物的核苷酸序列如seq idno.2～3所示。

5.根据权利要求2所述的茭白zlpds基因vigs沉默体系的构建方法，其特征在于，所述fomv-int片段的获得：以拟南芥int片段核苷酸序列为模版，所用引物的核苷酸序列如seqid no.10～11所示。

6.根据权利要求2所述的茭白zlpds基因vigs沉默体系的构建方法，其特征在于，所述zlpds反向特异性片段的获得：以茭白cdna为模版扩增，所用引物的核苷酸序列如seq idno.5～6所示。

7.根据权利要求1所述的茭白zlpds基因vigs沉默体系的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述的摩擦接种法包括以下步骤：用含有pfomv-zlpds质粒的农杆菌注射烟草，培养4～6天后将烟草研磨成汁液，在茭白的中心叶的1/2处先用毛刷轻轻擦拭，然后再蘸取烟草汁液擦拭转接，2min后用清水冲洗。

8.根据权利要求7所述的茭白zlpds基因vigs沉默体系的构建方法，其特征在于，用于接种的茭白为3～4叶期。

9.根据权利要求1所述的茭白zlpds基因vigs沉默体系的构建方法，其特征在于，茭白在接种后的培养条件为25～28℃，14h/10h光/暗周期，接种后的48h内先加湿器保持湿度90％左右，48h后正常湿度培养。

10.根据权利要求1～9任一项所述的构建方法构建得到的茭白zlpds基因vigs沉默体系。

技术总结
本发明公开了一种茭白ZlPDS基因VIGS沉默体系的构建方法及其产品，通过构建含有茭白ZlPDS基因特异性片段的狗尾草花叶病毒(FoMV)介导基因沉默表达载体pFoMV‑PDS质粒，并利用农杆菌介导法转化茭白，诱导目标基因ZlPDS发生沉默，有效降低了ZlPDS基因的表达水平，能够在茭白植株内进行持续较长时间的扩散传播，且导致叶片出现白化现象。本发明在茭白中建立了一种沉默效率高的茭白ZlPDS基因VIGS沉默体系，可用于验证目标基因功能，克服了茭白遗传转化困难，简化操作步骤，为研究茭白基因功能奠定了基础。

技术研发人员：张治平,施汪杰,缪旻珉,曾晓萍,宋思晓
受保护的技术使用者：扬州大学
技术研发日：
技术公布日：2024/10/31