一种展青霉素的纳米抗体及应用

本发明涉及免疫检测，更具体地，涉及一种展青霉素的纳米抗体及应用

背景技术：

1、展青霉素(patulin,pat)又称棒曲霉素,是一类多聚乙酰内酯类真菌毒素,主要由青霉属(penicillium)、曲霉属(aspergillus)和丝衣霉属(byssochlamys)等真菌产生。由真菌毒素污染造成的食品安全问题正成为世界关注的焦点，展青霉素具有致畸、致癌、致突变、免疫损伤和神经损伤等毒性。它在多种水果及其制品、蔬菜、谷物等中均有检出，以水果及其制品中污染较为严重。

2、国内外普遍采用的pat检测方法主要包括薄层层析色谱法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱法等。虽然，仪器检测方法具备高准确度和低检出限等优势，但是由于其存在前处理过程复杂、检测时间长和成本高等问题,且难以满足快速检测的要求。

3、基于抗体的免疫分析法可以实现真菌毒素的快速检测，具有操作简单、高特异性、高灵敏度和高通量等优点。但是，由于是直接利用pat设计半抗原，由于pat其不稳定性导致了，利用其设计得到的半抗体制备pat抗体，均效果不佳。其中，利用半戊二酸展青霉素衍生物制备得到了多克隆抗体，但抗体特异性和滴度均不高，限制了免疫分析方法的应用；另一种衍生策略对展青霉素进行衍生处理，制备得到的多克隆抗体有一定的特异性，但在免疫分析中仍受多克隆不同批次间差异大的到限制。展青霉素具有分子量小、稳定性差、毒性高等问题；常规抗体的特异性、热稳定性、有机溶剂耐受性不高；利用其设计得到的半抗体制备pat基因工程抗体，均效果不佳。目前并未见针对展青霉素分析的纳米抗体制备研究，因此非常有必要提供一种展青霉素纳米抗体及其制备方法和应用。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种展青霉素的纳米抗体及应用。

2、本发明的第一个目的是提供一种展青霉素的纳米抗体。

3、本发明的第二个目的是提供一种展青霉素的纳米抗体的编码基因。

4、本发明的第三个目的是提供一种重组载体。

5、本发明的第四个目的是提供一种重组细胞。

6、本发明的第五个目的是提供任一所述纳米抗体、所述编码基因、所述重组载体、和/或所述重组细胞中的一种或几种在制备展青霉素的免疫学检测试剂盒中的应用。

7、本发明的第六个目的是提供一种非诊断目的检测展青霉素的方法。

8、本发明的第七个目的是提供一种展青霉素的免疫学检测试剂盒。

9、为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

10、本发明要求保护一种展青霉素的纳米抗体，所述纳米抗体包括框架区fr和互补决定区cdr，所述互补决定区cdr为：氨基酸序列如seq id no：6所示的cdr1，氨基酸序列如seqid no：7所示的cdr2和氨基酸序列如seq id no：8所示的cdr3。

11、优选地，所述框架区fr为：氨基酸序列如seq id no：2所示的fr1，氨基酸序列如seq id no：3所示的fr2，氨基酸序列如seq id no：4所示的fr3和氨基酸序列如seq id no：5所示的fr4。

12、更优选地，所述纳米抗体的氨基酸序列如seq id no：1所示。

13、本发明还要求保护以下内容：

14、一种展青霉素的纳米抗体的编码基因，所述编码基因编码如任一所述纳米抗体。

15、一种重组载体，所述重组载体连接有所述编码基因。

16、一种重组细胞，所述重组细胞含有所述重组载体、或能够表达权利要求1到3任一所述纳米抗体。

17、任一所述纳米抗体、所述编码基因、所述重组载体、和/或所述重组细胞中的一种或几种在制备展青霉素的免疫学检测试剂盒中的应用，也属于本发明的保护范围。

18、还要求保护一种非诊断目的检测展青霉素的方法，利用任一所述纳米抗体。

19、一种展青霉素的免疫学检测试剂盒，含有所述纳米抗体。

20、优选地，还含有包被有检测抗原的固相载体，所述检测抗原为展青霉素与载体蛋白偶联得到的展青霉素完全抗原。

21、更优选地，所述载体蛋白包括但不限于bsa或ova。

22、具体的，所述展青霉素与载体蛋白偶联得到的展青霉素完全抗原的制备方法为展青霉素、n,n'-羰基二咪唑和4-二甲氨基吡啶在n，n-二甲基甲酰胺中充分反应，固液分离取上清，为a液；载体蛋白的pbs缓冲液溶液为b液；a液逐渐滴入b液中，充分反应，固液分离取上清夜，纯化即得。

23、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

24、本发明以展青霉素人工抗原(展青霉素与载体蛋白bsa的偶联物)作为包被原，利用纳米抗体天然库筛选展青霉素纳米抗体，无需利用展青霉素人工抗原免疫驼科动物，避免展青霉素对动物的毒性作用；制备得到了一种展青霉素纳米抗体，并利用其建立了展青霉素免疫检测方法，其对展青霉素的检测限为0.12μg/ml，半抑制浓度为0.41μg/ml，线性范围为0.17～0.97μg/ml，该方法具有简便快速、特异性强、灵敏度较高的特点，可以用于食品中展青霉素的快速检测。

技术特征：

1.一种展青霉素的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体包括框架区fr和互补决定区cdr，所述互补决定区cdr为：氨基酸序列如seq id no：6所示的cdr1，氨基酸序列如seq idno：7所示的cdr2和氨基酸序列如seq id no：8所示的cdr3。

2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述框架区fr为：氨基酸序列如seqid no：2所示的fr1，氨基酸序列如seq id no：3所示的fr2，氨基酸序列如seq id no：4所示的fr3和氨基酸序列如seq id no：5所示的fr4。

3.根据权利要求1或2所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列如seqid no：1所示。

4.一种展青霉素的纳米抗体的编码基因，其特征在于，所述编码基因编码如权利要求1到3任一所述纳米抗体。

5.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体连接有权利要求4所述编码基因。

6.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含有权利要求5所述重组载体、或能够表达权利要求1到3任一所述纳米抗体。

7.权利要求1到3任一所述纳米抗体、权利要求4所述编码基因、权利要求5所述重组载体、和/或权利要求6所述重组细胞中的一种或几种在制备展青霉素的免疫学检测试剂盒中的应用。

8.一种非诊断目的检测展青霉素的方法，其特征在于，利用权利要求1到3任一所述纳米抗体。

9.一种展青霉素的免疫学检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求1或2所述纳米抗体。

10.根据权利要求9所述的免疫学检测试剂盒，其特征在于，还含有包被有检测抗原的固相载体，所述检测抗原为展青霉素与载体蛋白偶联得到的展青霉素完全抗原。

技术总结
本发明公开了一种展青霉素的纳米抗体及应用，本发明以展青霉素人工抗原(展青霉素与载体蛋白BSA的偶联物)作为包被原，利用纳米抗体天然库筛选展青霉素纳米抗体，无需利用展青霉素人工抗原免疫驼科动物，避免展青霉素对动物的毒性作用；制备得到了一种展青霉素纳米抗体，并利用其建立了展青霉素免疫检测方法，其对展青霉素的检测限为0.12μg/mL，半抑制浓度为0.41μg/mL，线性范围为0.17～0.97μg/mL，该方法具有简便快速、特异性强、灵敏度较高的特点，可以用于食品中展青霉素的快速检测。

技术研发人员：王锋,潘海军,马路凯,刘东杰,王琴,肖更生
受保护的技术使用者：仲恺农业工程学院
技术研发日：
技术公布日：2024/12/10