本发明属于生物,具体涉及一种双荧光报告系统及其应用。
背景技术:
1、单碱基编辑是一种基因组编辑的形式,可以在不引入双链dna断裂的情况下直接转换特定基因组位点上的单个核苷酸,其在用于纠正基因突变的治疗工具方面具有巨大潜力。目前已经有许多文献报道了使用单碱基编辑器从基因水平上纠正动物疾病模型的基因突变。常见的单碱基编辑器包括ncas9连接脱氨酶,在sgrna的引导下,ncas9连接脱氨酶定位目标基因组位置发挥作用。
2、然而,在筛选单碱基编辑所需的sgrna方面仍缺乏方便快捷的手段;同时,筛选实验需要用到患者的细胞或者是专门构建的细胞模型,增加了实验的复杂性,因此需要开发更为方便的筛选方法。
3、荧光蛋白在生物学研究的许多领域包括基因编辑方面都具有广泛的应用。目前已经开发出各种颜色的荧光蛋白,其中egfp和mcherry几乎能在所有荧光显微镜和流式细胞仪上被检测到,因而被广泛使用。通过将荧光蛋白基因与目标基因融合可以观察到目标基因的表达情况,但是对于基因组编辑方面,将荧光蛋白基因敲入至基因组当中有许多不便,限制了荧光蛋白在这方面的使用。
技术实现思路
1、本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此,本发明提出一种双荧光报告系统,并具体提供了该双荧光报告系统中包括的一种核酸分子,该双荧光报告系统减少了sgrna筛选试验中对细胞类型的限制,并且通过荧光可以快速判断sgrn a的基因编辑效率,大大简化了筛选sgrna所需的步骤。
2、本发明还提出一种生物材料。
3、本发明还提出一种试剂盒。
4、本发明还提出一种应用。
5、本发明还提出一种筛选sgrna的方法。
6、根据本发明的第一方面,提出了一种核酸分子,所述核酸分子从5’端至3’端依次包含:编码第一报告蛋白的第一报告基因、靶基因片段和编码第二报告蛋白的第二报告基因。
7、在本发明的一些实施方式中,所述第一报告蛋白和第二报告蛋白各自独立包括荧光素酶蛋白或荧光蛋白。在本发明的一些优选的实施方式中,所述荧光素酶蛋白选自荧火虫荧光素酶、海肾荧光素酶和高斯荧光素酶中的任意一种。
8、在本发明的一些优选的实施方式中,所述荧光蛋白选自绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白中的任意一种。
9、在本发明的一些更优选的实施方式中,所述绿色荧光蛋白包括gfp或egfp。
10、在本发明的一些更优选的实施方式中,所述蓝色荧光蛋白选自ebfp2、mtagbfp、sbfp2、mturquoise2和cerulean中的任意一种。
11、在本发明的一些更优选的实施方式中,所述红色荧光蛋白选自mcherry、tdtomato、dsred、mstrawberry和mapple中的任意一种。
12、在本发明的一些优选的实施方式中,所述第一报告蛋白和所述第二报告蛋白互不相同。
13、在本发明的一些更优选的实施方式中,所述第一报告蛋白为红色荧光蛋白。
14、在本发明的一些更优选的实施方式中,所述第一报告蛋白为mcherry。
15、在本发明的一些更优选的实施方式中,所述第二报告蛋白为绿色荧光蛋白。
16、在本发明的一些更优选的实施方式中,所述第二报告蛋白为egfp。
17、在本发明的一些实施方式中,所述核酸分子的核苷酸序列如seq id no:5所示。
18、根据本发明的第二方面,提出了生物材料,所述生物材料包含以下(1)~(7)中至少一种:
19、(1)包含本发明第一方面所述的核酸分子的表达盒;
20、(2)包含本发明第一方面所述的核酸分子的载体;
21、(3)包含(1)所述的表达盒的载体;
22、(4)包含本发明第一方面所述的核酸分子的转基因细胞系;
23、(5)包含(1)所述表达盒的转基因细胞系;
24、(6)包含(2)所述载体的转基因细胞系;
25、(7)包含(3)所述载体的转基因细胞系。
26、在本发明的一些实施方式中,所述转基因细胞系不包含繁殖材料。
27、在本发明的一些实施方式中,所述载体包括pcmv质粒载体。
28、根据本发明的第三方面,提出了试剂盒,所述试剂盒包括:如本发明第一方面所述的核酸分子和/或如本发明第二方面所述的生物材料。
29、在本发明的一些实施方式中,所述试剂盒还包括编码碱基编辑元件和基因编辑酶的核酸分子。
30、在本发明的一些优选的实施方式中,所述碱基编辑元件包括腺嘌呤脱氨酶或胞嘧啶脱氨酶。
31、在本发明的一些更优选的实施方式中,所述碱基编辑元件为腺嘌呤脱氨酶。
32、在本发明的一些优选的实施方式中,所述基因编辑酶包括ncas9。
33、根据本发明的第四方面,提出了(a)~(c)在评价sgrna介导的基因编辑活性中的应用:
34、(a)如本发明第一方面所述的核酸分子;
35、(b)如本发明第二方面所述的生物材料;
36、(c)如本发明第三方面所述的试剂盒。
37、根据本发明的第五方面,提出了一种筛选sgrna的方法,所述方法采用如本发明第三方面所述的试剂盒对待测sgrna进行筛选。
38、在本发明的一些实施方式中,所述方法包括以下步骤:
39、将含有如本发明第一方面所述核酸分子的表达载体、编码碱基编辑元件和基因编辑酶的表达载体和编码待测sgrna的表达载体共转染入宿主细胞中并进行培养;再检测宿主细胞的荧光表达情况用于评估sgrna的基因编辑活性。
40、本发明至少具有以下有益效果:
41、本发明提供的双荧光报告系统可以用于sgrna的筛选,对筛选试验采用的细胞类型没有限制;同时能够通过荧光蛋白的表达情况快速判断基因编辑效率,大大提高了筛选试验的效率。
1.一种核酸分子,其特征在于,所述核酸分子从5’端至3’端依次包含:编码第一报告蛋白的第一报告基因、靶基因片段和编码第二报告蛋白的第二报告基因。
2.根据权利要求1所述的核酸分子,其特征在于,所述第一报告蛋白和第二报告蛋白各自独立包括荧光素酶蛋白或荧光蛋白;
3.根据权利要求1所述的核酸分子,其特征在于,所述核酸分子的核苷酸序列如seq idno:5所示。
4.生物材料,其特征在于,所述生物材料包含以下(1)~(7)中至少一种:
5.试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括:如权利要求1~3任一项中所述的核酸分子和/或如权利要求4所述的生物材料。
6.根据权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括编码碱基编辑元件和基因编辑酶的核酸分子。
7.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,所述碱基编辑元件包括腺嘌呤脱氨酶或胞嘧啶脱氨酶;
8.(a)~(c)在评价sgrna介导的基因编辑活性中的应用:
9.一种筛选sgrna的方法,其特征在于,所述方法采用如权利要求5~7任一项中所述的试剂盒对待测sgrna进行筛选。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤: