一种毒芹碱半抗原、杂交瘤细胞株、抗体及应用

本发明涉及免疫化学，尤其是指一种毒芹碱半抗原、杂交瘤细胞株、抗体及应用。

背景技术：

1、毒芹碱(coniine，con)是代表毒参主要毒性作用的生物碱，以盐形式存在于毒芹等植物中。con无色呈碱性液体，有鼠臭气味，剧毒！误食可引起乏力、头晕、呕吐、昏睡、麻痹、窒息，严重时导致死亡，致死量为60mg～120mg。毒芹菜由于与可食用植物芹菜，茴香等外形相似，经常由于误食而引起毒芹碱中毒。公元前399年，苏格拉底因喝下含有毒芹碱的混合物而中毒身亡。且毒芹碱是化妆品禁用原料。

2、目前检测毒芹碱方法比较少，目前研究的检测方法主要是仪器分析方法，包括：薄层色谱法(tlc)和高效液相色谱-质谱联用技术(hplc-ms法)等。仪器分析方法灵敏度好、精确度高，检测限低，假阳性率低，特异性强，但是样品前处理处理复杂，需要专业的人员，并且仪器设备昂贵、难以满足现场快速检测的要求。相对于仪器分析，免疫学检测方法前处理简单，具有便捷、快速、操作简单的诸多优点，并可提高检测灵敏度，降低检测成本，从而在大量样品初筛检测与现场快速检测上具有得天独厚的优势与极大的发展潜力。

3、免疫学检测法是一种利用抗原抗体特异性结合反应来检测各种物质的方法，目前针对毒芹碱的单克隆抗体的制备几乎没有。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供了一种毒芹碱半抗原、杂交瘤细胞株、抗体及应用，对con具有较好特异性和检测灵敏度，可以用于检测毒芹菜及化妆品中con残留量。

2、本发明通过以下技术方案实现：

3、本发明第一个目的是提供一种毒芹碱半抗原，所述毒芹碱半抗原的结构式为：

4、

5、本发明第二个目的是提供所述毒芹碱半抗原的制备方法，包括以下步骤：

6、s1：将2-哌啶乙酸溶于有机溶剂中，加入edc和nhs进行反应；

7、s2：在步骤s1所得反应产物中加入4-氨基丁酸乙酯室温反应；

8、s3：将步骤s2所得反应产物进行碱解，得到所述毒芹碱半抗原。

9、反应路线为：

10、

11、在本发明的一个实施例中，步骤s1中，所述反应的温度为室温，时间为0.5h。

12、在本发明的一个实施例中，步骤s2中，所述反应的温度为室温，时间为4h。

13、在本发明的一个实施例中，步骤s3中，所述碱解的温度为80℃，时间为1h。

14、在本发明的一个实施例中，所述有机溶剂为dmf。

15、本发明第三个目的是提供一种毒芹碱完全抗原，由所述毒芹碱半抗原与载体蛋白制备得到。

16、在本发明的一个实施例中，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、钥孔血蓝蛋白和卵清蛋白中的一种或多种。

17、在本发明的一个实施例中，所述毒芹碱免疫原由毒芹碱半抗原与牛血清白蛋白或钥孔血蓝蛋白制备得到；所述毒芹碱包被原由毒芹碱半抗原与卵清蛋白制备得到。

18、当载体蛋白为牛血清白蛋白时所得毒芹碱免疫原的结构式为：

19、

20、当载体蛋白为卵清蛋白时所得毒芹碱包被原的结构式为：

21、

22、本发明第四个目的是提供一株分泌毒芹碱单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株由所述的毒芹碱半抗原通过合成毒芹碱完全抗原，免疫小鼠得到；已于2024年04月18日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.45918。

23、本发明第五个目的是提供一种毒芹碱单克隆抗体，由所述的杂交瘤细胞株分泌产生。

24、本发明第六个目的是提供一种组合物，包括所述的毒芹碱单克隆抗体。

25、本发明第七个目的是提供一种检测毒芹碱的试纸条，包括所述的毒芹碱单克隆抗体，或所述的组合物。

26、本发明第八个目的是提供一种检测毒芹碱的试剂盒，包括所述的毒芹碱单克隆抗体、所述的组合物或所述的试纸条。

27、在本发明的一个实施例中，所述试剂盒选自酶联免疫检测试剂盒、荧光免疫检测试剂盒或化学发光免疫检测试剂盒。

28、本发明第九个目的是提供所述的组合物、所述的试纸条或所述的试剂盒在检测毒芹碱中的应用。

29、本发明的还提供了上述con单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备方法，包括以下步骤，

30、(1)将2-哌啶乙酸羧基延长碳链作为半抗原；

31、(2)将所述半抗原与载体蛋白偶联，得到免疫原；

32、(3)将所述免疫原与弗氏佐剂混合乳化，对小鼠进行皮下免疫，筛选免疫效果好的小鼠；

33、(4)将步骤(3)筛选出的小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合，得到所述con单克隆抗体杂交瘤细胞株。

34、本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：

35、本发明提供了一种毒芹碱半抗原、杂交瘤细胞株、抗体及应用，本发明提供的细胞株分泌的单克隆抗体，对con具有较好检测灵敏度(ic50值为9.69μg/ml)和特异性，可实现con的检测，特别是对毒芹菜和化妆品中con残留量的检测，具有实际应用价值。

36、生物材料样品保藏：一株毒芹碱单克隆抗体杂交瘤细胞株is0，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心cgmcc，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2024年04月18日，保藏编号cgmccno.45918。

技术特征：

1.一种毒芹碱半抗原，其特征在于，所述毒芹碱半抗原的结构式为：

2.权利要求1所述毒芹碱半抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.一种毒芹碱完全抗原，其特征在于，由权利要求1所述毒芹碱半抗原与载体蛋白制备得到。

4.根据权利要求3所述的毒芹碱完全抗原，其特征在于，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、钥孔血蓝蛋白和卵清蛋白中的一种或多种。

5.一株分泌毒芹碱单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株由权利要求1所述的毒芹碱半抗原通过合成毒芹碱完全抗原，免疫小鼠得到；已于2024年04月18日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.45918。

6.一种毒芹碱单克隆抗体，其特征在于，由权利要求5所述的杂交瘤细胞株分泌产生。

7.一种组合物，其特征在于，包括权利要求6所述的毒芹碱单克隆抗体。

8.一种检测毒芹碱的试纸条，其特征在于，包括权利要求6所述的毒芹碱单克隆抗体，或权利要求4所述的组合物。

9.一种检测毒芹碱的试剂盒，其特征在于，包括权利要求6所述的毒芹碱单克隆抗体、权利要求7所述的组合物或权利要求8所述的试纸条。

10.权利要求7所述的组合物、权利要求8所述的试纸条或权利要求9所述的试剂盒在检测毒芹碱中的应用。

技术总结
本发明涉及一种毒芹碱半抗原、杂交瘤细胞株、抗体及应用，属于免疫化学技术领域。该杂交瘤细胞株IS0，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期2024年04月18日，保藏编号为CGMCCNo.45918。本发明提供的细胞株分泌的单克隆抗体，对毒芹碱具有较好的检测灵敏度(IC<subgt;50</subgt;值为9.69μg/mL)和特异性，可实现毒芹碱的快速检测，为毒芹菜和化妆品中毒芹碱的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。

技术研发人员：吴晓玲,李小芳,胥传来,匡华,徐丽广,孙茂忠,刘丽强,郝昌龙,宋珊珊,吴爱红,郭玲玲,胥欣欣,瞿爱华
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：
技术公布日：2025/1/23