CAR-T细胞与胰腺癌类器官共培养评价杀伤效果的方法与流程

本发明涉及肿瘤免疫疗法领域，具体涉及car-t细胞与胰腺癌类器官共培养评价杀伤效果的方法。

背景技术：

1、近年来，肿瘤免疫疗法在癌症治疗中非常火热。肿瘤免疫学治疗的目的是激发或调动机体的免疫系统，增强肿瘤微环境抗肿瘤免疫力，从而控制和杀伤肿瘤细胞。随着免疫治疗的兴起也推动了肿瘤研究的发展，但是由于人源化体系的复杂性、免疫系统的部分或无效重组建等问题，致使免疫肿瘤模型面临着巨大的挑战，临床上迫切需要能够用于个体化验证疗效的体外模型。

2、但是传统二维细胞培养存在各种方面的限制，而新型的类器官初步具备了起源组织复杂的细胞微环境，且在基因组及分子标志等方面与体内来源组织或器官高度相似。类器官与免疫细胞共培养的环境使类器官的体外培养增加了免疫细胞浸润的环境刺激，更贴近体内生长环境，为自身免疫疾病、肿瘤及其相关免疫疗法等研究提供理想的实验平台。因此构建类器官和免疫细胞的共同培养体系，在疾病研究、药物研发和肿瘤免疫治疗等方面具有广泛的应用前景。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种car-t细胞与胰腺癌类器官共培养评价杀伤效果的方法；通过类器官和免疫细胞的共培养，有助于更深入地了解疾病的发生和发展过程，探索新的治疗策略和药物研发方法，为癌症免疫治疗提供新的模型和手段，为肿瘤个体化治疗提供有力支持。

2、为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、1、car-t细胞与胰腺癌类器官共培养评价杀伤效果的方法，取胰腺癌类器官用tryple消化酶进行消化传代，传代后与悬浮培养过夜，然后按照效靶比50：1～100：1将car-t细胞与胰腺癌类器官混合，然后加入共培养培养基共培养至少4h，通过annexin v-fitc/pi染色观察类器官完整形态或采用celltoxtmgreen cytotoxicity assay定量检测分析杀伤效果。

4、t细胞是肿瘤免疫中的主力免疫细胞，将胰腺癌类器官与活化的外周血t细胞(car-t细胞)共培养建立模型，并对肿瘤类器官被car-t细胞杀伤的效果进行定性和定量评价，从而在体外搭建能够评估t细胞在体内潜在杀伤能力的评价平台。

5、本发明优选的，所述共培养培养基以胰腺癌类器官培养基为母液，添加il2和基质胶，至il2终浓度为200iu/ml，基质胶的体积分数为5％。

6、所述胰腺癌类器官培养基各组分质量比如下：10mm hepes，1％ glutamax，100μg/ml primocin，1％青霉素-链霉素，500nm a83-01，1％ b27 supplement，10μm y-27632，1.56mm n-acetylcysteine，10mm nicotinamide，10ng/ml fgf10，10μm forskolin，300ng/ml wnt-3a，500ng/ml r-spondin1，30ng/ml noggin，其余为基础培养基advanced dmem-f12。

7、本发明优选的，car-t细胞培养使用的培养基为：10％灭活fbs，1％青链霉素，1％丙酮酸钠，1％非必需氨基酸，200iu/ml il2，余量为基础培养基rpmi 1640。

8、本发明优选的，所述annexin v-fitc/pi染色是将annexin v-fitc和pi工作液用dpbs按照annexin v-fitc：dpbs体积比为1：10，pi：dpbs体积比为1:8稀释。

9、本发明优选的，所述celltoxtmgreen cytotoxicity assay定量检测分析是celltoxtmgreen cytotoxicity assay试剂盒融解后，取assay buffer和celltoxtmgreendye按体积比为200:1混合制成凋亡检测工作液，然后向检测孔中加入凋亡检测工作液，室温避光孵育15min，酶标仪检测ex/em＝490/525nm处的荧光强度。

10、本发明的有益效果在于：本发明公开了car-t细胞与胰腺癌类器官共培养评价杀伤效果的方法，通过类器官和免疫细胞的共培养，有助于更深入地了解疾病的发生和发展过程，探索新的治疗策略和药物研发方法，为癌症免疫治疗提供新的模型和手段，通过对肿瘤类器官被car-t细胞杀伤的效果进行定性和定量评价，从而在体外搭建能够评估t细胞在体内潜在杀伤能力的评价平台。

技术特征：

1.car-t细胞与胰腺癌类器官共培养评价杀伤效果的方法，其特征在于：取胰腺癌类器官用tryple消化酶进行消化传代，传代后与悬浮培养过夜，然后按照效靶比50：1～100：1将car-t细胞与胰腺癌类器官混合，然后加入共培养培养基共培养至少4h，通过annexin v-fitc/pi染色观察类器官完整形态或采用celltoxtmgreen cytotoxicity assay定量检测分析杀伤效果。

2.根据权利要求1所述car-t细胞与胰腺癌类器官共培养评价杀伤效果的方法，其特征在于：所述共培养培养基以胰腺癌类器官培养基为母液，添加il2和基质胶，至il2终浓度为200iu/ml，基质胶的体积分数为5％；

3.根据权利要求1所述car-t细胞与胰腺癌类器官共培养评价杀伤效果的方法，其特征在于：car-t细胞培养使用的培养基为：10％灭活fbs，1％青链霉素，1％丙酮酸钠，1％非必需氨基酸，200iu/ml il2，余量为基础培养基rpmi 1640。

4.根据权利要求1所述car-t细胞与胰腺癌类器官共培养评价杀伤效果的方法，其特征在于：所述annexin v-fitc/pi染色是将annexin v-fitc和pi工作液用dpbs按照annexinv-fitc：dpbs体积比为1：10，pi：dpbs体积比为1:8稀释。

5.根据权利要求1所述car-t细胞与胰腺癌类器官共培养评价杀伤效果的方法，其特征在于：所述celltoxtmgreen cytotoxicity assay定量检测分析是celltoxtmgreencytotoxicity assay试剂盒融解后，取assay buffer和celltoxtmgreen dye按体积比为200:1混合制成凋亡检测工作液，然后向检测孔中加入凋亡检测工作液，室温避光孵育15min，酶标仪检测ex/em＝490/525nm处的荧光强度。

技术总结
本发明公开了CAR‑T细胞与胰腺癌类器官共培养评价杀伤效果的方法，具体方法是取胰腺癌类器官用TryplE消化酶进行消化传代，传代后悬浮培养过夜，然后按照效靶比50：1～100：1将CAR‑T细胞与胰腺癌类器官混合，然后加入共培养培养基共培养至少4h，通过Annexin V‑FITC/PI染色观察类器官完整形态或采用CellTox<supgt;TM</supgt;Green Cytotoxicity Assay定量检测分析杀伤效果；本发明通过类器官和免疫细胞的共培养，有助于更深入地了解疾病的发生和发展过程，探索新的治疗策略和药物研发方法，为癌症免疫治疗提供新的模型和手段，为肿瘤个体化治疗提供有力支持。

技术研发人员：刘海洋,苏芮,于升,阚方明,米小容,何晓燕,黄璘
受保护的技术使用者：北京嘉士腾医学检验实验室有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/11/28