一种耐高温的碱性蛋白酶及其制备方法和应用

本发明涉及基因工程，具体涉及一种耐高温的碱性蛋白酶及其制备方法和应用。

背景技术：

1、蛋白酶是一种温和的高效催化剂，它能够催化大分子蛋白质肽键的水解，是工业上应用最广的一类酶，其年销量占世界酶制剂市场的60％以上。碱性蛋白酶是蛋白酶家族中最重要的一类蛋白酶，它能够在极端的碱性环境下发挥作用，被广泛应用于洗涤、食品、皮革、医药等行业。碱性蛋白酶的年产量占全球酶生产量的50％，超过三分之二的碱性蛋白酶应用于洗涤工业，它在液体洗涤剂产品中能够帮助去除衣物上的蛋白质污渍，例如血渍、汗渍等。在液体洗涤剂中的碱性蛋白酶大部分是由微生物发酵而来，工业化生产中常用的菌种包括地衣芽孢杆菌、嗜碱性芽孢杆菌、枯草杆菌等，但在实际工业应用中这些天然菌种分泌出来的碱性蛋白酶的酶活及稳定性往往都达不到生产要求。目前现有技术中的碱性蛋白酶在应用中主要面临以下几个方面的问题：(1)耐高温性能差：许多现有的碱性蛋白酶在高温环境下活性迅速降低；(2)酶活性降低：在高温条件下，蛋白酶的活性往往显著下降，导致处理效率低下；(3)稳定性不足：许多碱性蛋白酶在高温环境中不稳定，容易失去活性或发生变性。这些问题导致蛋白酶无法在高温条件的工业过程中应用，不能满足工业生产的需求。因此采用基因工程手段，获得高活性、高稳定性是碱性蛋白酶的工业化应用的前提。

2、目前，有研究者对蛋白酶进行定点突变以提高热稳定性，如申请号为202111167371.5的中国发明专利申请，公开了“一种稳定性高的碱性蛋白酶突变体及其在液体洗涤剂中的应用”，对野生型蛋白酶pb92进行定点突变，50℃热处理30min，野生型蛋白酶pb92酶活力为60％，而突变后的jd118仍保留70％的酶活力。虽然突变体的热稳定性有提高，但其提高程度仍未达到工业要求。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种耐高温的碱性蛋白酶及其制备方法和应用。本发明通过基因工程手段对碱性蛋白酶基因savinase进行改造，获得了一种在高温环境下具有高稳定性和高活性的碱性蛋白酶。这种改进不仅提升了蛋白酶在高温条件下的性能，还扩展了其在各类工业过程中的应用范围。本发明得到的蛋白酶savinasegl是一种新的能够应用于洗涤领域的耐高温碱性蛋白酶，大大降低了生产所需成本，提高了生产效率。

2、为实现上述目的，本发明所设计的技术方案如下：

3、本发明提供了一种耐高温的碱性蛋白酶，所述耐高温的碱性蛋白酶与如seq idno：3所示的野生型碱性蛋白酶的氨基酸序列相比，第9位的丝氨酸突变为谷氨酰胺，第133位丙氨酸突变为谷氨酰胺，第141位丝氨酸突变为酪氨酸，第238位天冬酰胺突变为酪氨酸。

4、进一步地，所述野生型碱性蛋白酶的氨基酸序列来源于迟缓芽孢杆菌bacilluslentus gibson 1935。

5、再进一步地，所述耐高温的碱性蛋白酶的氨基酸序列如seq id no：1所示。

6、本发明还提供了一种编码所述的耐高温的碱性蛋白酶的基因，所述耐高温的碱性蛋白酶的基因的核苷酸序列如seq id no：2所示。

7、本发明还提供了一种耐高温的碱性蛋白酶的制备方法，包括以下步骤：

8、(1)获取耐高温的碱性蛋白酶savinasegl的基因序列，在基因两端分别引入限制性内切酶切位点ecorⅰ和salⅰ，将该基因由ecorⅰ和salⅰ酶切并收集酶切产物，获得savinasegl基因片段；

9、(2)将载体ppiczαa同时由ecorⅰ和salⅰ酶切并收集酶切产物，获得ppiczαa载体片段；

10、(3)将savinasegl基因片段和ppiczαa载体片段用t4 dna连接酶连接，获得ppiczαa-savinasegl重组表达载体；

11、(4)将ppiczαa-savinasegl重组表达载体转入宿主菌毕赤酵母x-33中，摇瓶发酵培养，离心获得上清液，即为耐高温的碱性蛋白酶。

12、进一步地，所述步骤(1)和(2)中，酶切条件为37℃、4h；

13、所述步骤(3)中，连接酶连接条件为16℃、8～10h；

14、所述步骤(4)中，载体转入宿主菌的转化方式为电转化。

15、本发明还提供了一种耐高温的碱性蛋白酶重组表达载体，其特征在于：重组表达载体包含编码所述的耐高温的碱性蛋白酶的基因，表达载体为ppiczαa。

16、本发明还提供了一种耐高温的碱性蛋白酶重组菌株，重组菌株包含所述重组表达载体，所述重组菌株的宿主菌为毕赤酵母x-33。

17、本发明还提供了一种所述耐高温的碱性蛋白酶的应用，所述耐高温的碱性蛋白酶应用于血渍和蛋黄污渍的洗涤。

18、进一步地，将100μl耐高温的碱性蛋白酶与0.1～0.3g洗涤剂混合配制成加酶洗涤剂，其中碱性蛋白酶的酶活力为50～55u；使用加酶洗涤剂对血渍和蛋黄污渍进行洗涤；洗涤条件为：35～45℃下浸泡10～15min，在30℃下110～120r/min洗涤25～35min，清水冲洗2～3次。

19、本发明的有益效果：

20、1、显著提高耐高温性能：通过特定序列优化和突变筛选，改造后的耐高温碱性蛋白酶在高温环境下表现出显著的稳定性，能够在更高的温度下保持活性。这一特性使其在需要高温条件的工业过程中表现出更高的稳定性和效率。例如，在60℃以上的高温环境中，改造后的耐高温碱性蛋白酶仍能保持较高的活性。

21、2、提高酶活性：改造后的耐高温碱性蛋白酶不仅在高温下稳定性提高，同时在高温环境下的酶活性也显著增强。这样可以在高温工业流程中更有效地进行蛋白质的水解，提高生产效率。

22、3、提升稳定性：本发明通过基因改造，显著提升了碱性蛋白酶在高温环境中的稳定性，减少了酶变性和失活的可能。

技术特征：

1.一种耐高温的碱性蛋白酶，其特征在于：所述耐高温的碱性蛋白酶与如seq id no：3所示的野生型碱性蛋白酶的氨基酸序列相比，第9位的丝氨酸突变为谷氨酰胺，第133位丙氨酸突变为谷氨酰胺，第141位丝氨酸突变为酪氨酸，第238位天冬酰胺突变为酪氨酸。

2.根据权利要求1所述耐高温的碱性蛋白酶，其特征在于：所述野生型碱性蛋白酶的氨基酸序列来源于迟缓芽孢杆菌。

3.根据权利要求1所述耐高温的碱性蛋白酶，其特征在于：所述耐高温的碱性蛋白酶的氨基酸序列如seq id no：1所示。

4.一种编码如权利要求1所述的耐高温的碱性蛋白酶的基因，其特征在于：所述耐高温的碱性蛋白酶的基因的核苷酸序列如seq id no：2所示。

5.一种耐高温的碱性蛋白酶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于：所述步骤(1)和(2)中，酶切条件为37℃、4h；

7.一种耐高温的碱性蛋白酶重组表达载体，其特征在于：重组表达载体包含如权利要求4所述基因，表达载体为ppiczαa。

8.一种耐高温的碱性蛋白酶重组菌株，其特征在于：重组菌株包含如权利要求7所述重组表达载体，所述重组菌株的宿主菌为毕赤酵母x-33。

9.一种如权利要求1所述耐高温的碱性蛋白酶的应用，其特征在于：所述耐高温的碱性蛋白酶应用于血渍和蛋黄污渍的洗涤。

10.根据权利要求9所述应用，其特征在于：将100μl耐高温的碱性蛋白酶与0.1～0.3g洗涤剂混合配制成加酶洗涤剂，其中碱性蛋白酶的酶活力为50～55u；使用加酶洗涤剂对血渍和蛋黄污渍进行洗涤；洗涤条件为：35～45℃下浸泡10～15min，在30℃下110～120r/min洗涤25～35min，清水冲洗2～3次。

技术总结
本发明公开了一种耐高温的碱性蛋白酶及其制备方法和应用。该耐高温的碱性蛋白酶SavinaseGL氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。经重新设计与改造而来，实现具有耐高温性质和高产量的碱性蛋白酶。本发明可以实现该耐高温的碱性蛋白酶SavinaseGL在工业中的应用，能够得到具有很好应用前景的碱性蛋白酶的生产菌种。本发明得到的SavinaseGL是一种新的能够应用于洗涤领域的耐高温碱性蛋白酶，大大降低了生产所需成本，提高了生产效率。

技术研发人员：雷磊,郭曦丹,徐映雨
受保护的技术使用者：武汉轻工大学
技术研发日：
技术公布日：2024/11/4