一种罗伞树碳糖基转移酶AqCGT51基因及在制备岩白菜素上的应用

本发明属于生物，具体涉及一种罗伞树碳糖基转移酶aqcgt51基因及在制备岩白菜素上的应用。

背景技术：

1、罗伞树(ardisia quinquegona)为报春花科紫金牛属(ardisia)植物。该属植物在中国主要产于广东、广西、福建、台湾、云南等地，在马来半岛至琉球群岛也有分布，常见生长在海拔200-1000米的山坡、林中，在林中溪边阴湿处较为常见。罗伞树植物中所含药用成分较多,岩白菜素是主要有效成分之一。岩白菜素因其多种药理活性被广泛关注，如镇咳、抗炎、抗焦虑、抗氧化、抗疟疾、抗癌、治疗糖尿病、抗肝毒性、免疫调节和神经保护等。与吗啡类抑制中枢止咳药不同，岩白菜素对咳嗽中枢具有选择性抑制作用，对其他神经中枢无抑制作用，具有毒副作用小、不良反应少、连续使用不产生耐药性等特点。岩白菜素已被制成多种剂型在国内广泛用于治疗呼吸系统疾病，如复方岩白菜素片，岩白菜素胶囊等。

2、岩白菜素生物合成前体为2-葡萄糖-4-甲氧基没食子酸经由分子内脱水后重排后闭环生成；2-葡萄糖-4-甲氧基没食子酸由4-甲氧基没食子酸在碳糖基转移酶(cgt,c-glucosyltransferase)的催化下以尿苷二磷酸葡萄糖(udp-glucose)为糖基供体在2位连接葡萄糖生成；4-甲氧基没食子酸由没食子酸氧位甲基转移酶(omt,o-methyltransferase)以没食子酸为底物，s-腺苷-蛋氨酸(sam,s-adenosyl-methionine)为甲基供体催化生成；没食子酸由莽草酸经过莽草酸脱氢酶(sdh,shikimatedehydrogenases)在nadp+为质子供体的条件下催化生成。

3、随着慢性支气管炎疾病日益增多，岩白菜素原料药材缺口日益增大。目前市场上的岩白菜素原料主要依靠提取获得，用于提取岩白菜素的干货药材年需求量已达2000余吨。近几十年的大肆采挖已经造成野生资源储量锐减，濒临枯竭。同时，原产地海拔高、山区多、气候条件寒冷，导致人工大面积栽培困难，进一步扩大了岩白菜素原料市场缺口，价格逐年攀升。近年来，随着合成生物学领域的快速发展，利用合成生物学技术生产天然药物单体可以有效解决上述问题。但是，要搞清这些活性成分的生物合成途径，必需鉴定这些途径中相关的关键基因，发掘这些催化酶基因成为研究植物代谢产物生物合成途径的关键环节。当前，4-甲氧基没食子酸在c-2位发生糖基化反应催化形成2-葡萄糖-4-甲氧基没食子酸的合成路径已经清晰，负责糖基化的碳糖基转移酶的功能得到验证较少，影响了岩白菜素生物合成工作的推进。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供了一种罗伞树碳糖基转移酶aqcgt51基因，可作为岩白菜素的生物合成调控基因以及应用于制备岩白菜素。

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

3、本发明第一方面提供一种罗伞树碳糖基转移酶aqcgt51基因，所述罗伞树碳糖基转移酶aqcgt51基因的核酸序列如seq id no.1所示，序列全长1455bp。

4、本发明第二方面提供了上述罗伞树碳糖基转移酶aqcgt51基因所编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示，编码了484个氨基酸残基。

5、本发明第三方面提供了含有上述罗伞树碳糖基转移酶aqcgt51基因的重组质粒。

6、作为优选，所述重组质粒通过将上述的罗伞树碳糖基转移酶aqcgt51基因与pet28a载体同源重组获得，命名为pet28a-aqcgt51。

7、本发明第四方面提供了一种转基因工程菌，含有所述的重组质粒，或，所述基因工程菌的基因组中整合有外源的上述的罗伞树碳糖基转移酶aqcgt51基因。

8、作为优选，所述转基因工程菌为大肠杆菌bl21(de3)菌株。

9、本发明第五方面提供了一种罗伞树碳糖基转移酶aqcgt51基因在制备岩白菜素的应用。

10、作为优选，以4-甲氧基没食子酸和糖基供体尿苷二磷酸葡萄糖(udp-glucose)为原料，在由上述的罗伞树碳糖基转移酶aqcgt51基因编码得到的罗伞树碳糖基转移酶的催化下，在4-甲氧基没食子酸的c-2位上进行糖基化反应，生成岩白菜素。

11、本发明通过重组质粒，在体外表达后获得目标蛋白，经进一步对底物4-甲氧基没食子酸进行催化，直接生成岩白菜素。

12、本发明所述的罗伞树碳糖基转移酶aqcgt51基因，是从罗伞树的植株中，通过转录组测序及生物信息学技术，经大量实验后筛选后得以鉴定出来的；采用rna试剂后提取罗伞树根状茎的rna，并反转录成cdna后进行pcr扩增获得。所述的罗伞树碳糖基转移酶aqcgt51基因的扩增引物如下所示：

13、5'f：atgtccaactccggcg；(seq id no.3)

14、3'r：ctaatttttcttcaacgtagaaatt；(seq id no.4)

15、此外，与载体pet28a进行同源重组时，aqcgt51基因则需要使用带同源壁的引物进行扩增及回收，带同源壁的引物如下：

16、上游同源臂引物：

17、5'f：cagcaaatgggtcgcggatccatgtccaactccggcg；(seq id no.5)

18、下游同源臂引物：

19、3'r：acggagctcgaattcggatccctaatttttcttcaacgtagaaatt；(seq id no.6)

20、从罗伞树中分离并鉴定的碳糖基转移酶aqcgt51基因，可作为罗伞树的分子辅助育种的重要标记基因，同时也可作为酵母底盘细胞构建中生产岩白菜素的重要候选基因。

21、本发明与现有技术相比，其有益效果为：

22、(1)本发明提供罗伞树碳糖基转移酶aqcgt51基因，可作为岩白菜素的生物合成调控基因，并应用于制备岩白菜素。

23、(2)随着生物信息学技术的飞速发展，极大地推进了岩白菜素生物合成路径关键酶基因的挖掘，本发明中岩白菜素的生物合成调控基因即罗伞树碳糖基转移酶aqcgt51基因，是首次鉴定并成功验证，开辟了一种生产岩白菜素的生物合成新方法。本发明通过大肠杆菌异源表达蛋白在体外进行酶催化的方式来获得目标产物，采用体外生物合成，进行定向生产，具有副产物少等优点。

24、(3)本发明还提供了含有该碳糖基转移酶aqcgt51基因的重组质粒、基因工程菌和重组蛋白，为通过生物工程方法大量合成岩白菜素，进一步为构建产岩白菜素的细胞工厂研究奠定基础。

25、(4)通过体外生物合成岩白菜素，可控性强，可以减少对原料种植的需求，生产产物单一，便于后期岩白菜素的分离和纯化，还可减少化学合成困难，合成路径复杂等问题。所述罗伞树碳糖基转移酶aqcgt51基因作为岩白菜素生物合成的关键基因，还可用于紫金牛等富含岩白菜素植物的育种研究。

技术特征：

1.一种罗伞树碳糖基转移酶aqcgt51基因，其特征在于，所述罗伞树碳糖基转移酶aqcgt51基因的核酸序列如seq id no.1所示。

2.权利要求1所述的罗伞树碳糖基转移酶aqcgt51基因编码蛋白，其特征在于，该编码蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。

3.含有权利要求1所述的罗伞树碳糖基转移酶aqcgt51基因的重组质粒。

4.根据权利要求3所述的含有罗伞树碳糖基转移酶aqcgt51基因的重组质粒，其特征在于，将罗伞树碳糖基转移酶aqcgt51基因与pet28a载体同源重组，获得pet28a - aqcgt51重组质粒。

5.一种转基因工程菌，其特征在于，权利要求3或4所述的重组质粒，或，所述基因工程菌的基因组中整合有外源的权利要求1所述的罗伞树碳糖基转移酶aqcgt51基因。

6.根据权利要求5所述的转基因工程菌，其特征在于，所述转基因工程菌为大肠杆菌bl21(de3)菌株。

7.权利要求1所述的罗伞树碳糖基转移酶aqcgt51基因在制备岩白菜素的应用。

8.根据权利要求7所述的罗伞树碳糖基转移酶aqcgt51基因在制备岩白菜素的应用，其特征在于，以4-甲氧基没食子酸作为底物，尿苷二磷酸葡萄糖（udp-glucose）为糖基供体，在由上述的罗伞树碳糖基转移酶aqcgt51基因编码得到的罗伞树碳糖基转移酶的催化下，在4-甲氧基没食子酸的c-2位上进行糖基化反应，生成岩白菜素。

技术总结
本发明涉及一种罗伞树碳糖基转移酶AqCGT51基因及在制备岩白菜素上的应用，属于生物技术领域。该罗伞树碳糖基转移酶AqCGT51基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，序列全长1455bp；编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码了484个氨基酸残基。本发明罗伞树碳糖基转移酶AqCGT51基因可作为岩白菜素的生物合成调控基因，并应用于制备岩白菜素，应用前景显著，易于推广应用。

技术研发人员：郝冰,杜江顺,刘祥宇,王益娜,陈碧环,陈丽,叶懿江,欧阳睿晨,毛柯轶,李姝娴,李宏诚,张广辉,杨生超,卢迎春,和四梅
受保护的技术使用者：云南农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/12/19