水稻稻曲病抗病基因FSR1的KASP分子标记及引物、试剂盒和应用的制作方法

本发明生物，具体涉及水稻稻曲病抗病基因fsr1的kasp分子标记及引物、试剂盒和应用。

背景技术：

1、水稻是世界上最重要的粮食作物之一，养活了世界上一半以上的人口。水稻稳产对维持粮食安全具有重要作用。近来年，随着高产和杂交水稻的大面积种植、化肥的过度施用及全球气候变化等因素的影响，稻曲病(rfs，rice false smut)逐渐发展为水稻产区的一种主要病害。稻曲病是由稻曲病菌(ustilaginoideavirens)引起的真菌性病害，可造成水稻减产30％以上，降低稻米的品质，同时稻曲病菌还会产生对细胞分裂具有强烈抑制作用的多种毒素，威胁人畜的安全。当前生产中防治稻曲病主要采用化学杀菌剂和农业栽培措施等方法，迫切需要开发稻曲病的绿色防控新技术体系。培育抗稻曲病水稻品种是稻曲病绿色防控新技术体系的重要基础，因此，亟需挖掘稻曲病抗性基因和开发对应的分子标记，创制抗稻曲病水稻材料，为培育抗病品种奠定基础。

2、利用分子标记可以抗病基因的快速鉴定和有效育种利用。随着基因组快速发展，基于个体间单碱基多态性(single nucleotide polymorphism,snp)标记逐步普及，其中，kasp(kompetitive allele specific pcr)标记技术利用特异荧光引物对目标snp位点进行精准扩增，通过扫描荧光信号进行基因型分型，无需电泳、照相和读带分析，具有快速、精准、低成本、自动化的优势。该技术广泛应用于作物的基因定位和分子标记辅助选择育种中。稻曲病抗病基因fsr1鉴定自抗病品种nj11中，通过与感病品种cg3杂交构建的遗传群体已完成抗病基因fsr1精细定位，随后通过基因编辑和遗传互补已明确了稻曲病抗病基因fsr1。因此开发水稻稻曲病抗病基因fsr1的kasp分子标记，对于实现抗稻曲病基因的快速检测和分子选择育种具有重要的价值和意义。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供水稻稻曲病抗病基因fsr1的kasp分子标记及引物、试剂盒和应用的技术方案。本发明克服传统抗病育种中稻曲病抗性表型选择易受环境影响的缺点，能够用于稻曲病抗病基因fsr1快速鉴定和稻曲病抗病育种辅助选择。

2、本发明具体采用以下技术方案实现：

3、本发明第一方面提供了水稻稻曲病抗病基因fsr1的kasp分子标记，该kasp分子标记包括tmt1p5引物组和tmt1p6引物组，所述tmt1p5引物组包括tmt1p5f1、tmtp5f2和tmtp5r，所述tmt1p5f1的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述tmtp5f2的核苷酸序列如seqid no.2所示，所述tmtp5r的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述tmt1p6引物组包括tmt1p6f1、tmtp6f2和tmtp6r，所述tmt1p6f1的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述tmtp6f2的核苷酸序列如seq id no.5所示，所述tmtp6r的的核苷酸序列如seq id no.6所示。

4、本发明第二方面提供了一种检测水稻稻曲病抗病基因fsr1的引物组，该引物组包括tmt1p5引物组和tmt1p6引物组，所述tmt1p5引物组包括tmt1p5f1、tmtp5f2和tmtp5r，所述tmt1p5f1的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述tmtp5f2的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述tmtp5r的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述tmt1p6引物组包括tmt1p6f1、tmtp6f2和tmtp6r，所述tmt1p6f1的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述tmtp6f2的核苷酸序列如seq id no.5所示，所述tmtp6r的的核苷酸序列如seq id no.6所示。

5、本发明第三方面提供了含有所述引物组的水稻稻曲病抗病基因fsr1检测试剂盒。

6、本发明第四方面提供了上述的分子标记、上述的引物组以及上述的试剂盒在检测水稻稻曲病抗病基因fsr1中的应用。

7、本发明第五方面提供了一种水稻稻曲病抗病基因fsr1的检测方法，其包括以下步骤：

8、待检测水稻样品基因组为模版，采用tmt1p5引物组和tmt1p6引物组进行荧光定量pcr扩增，并对扩增结果进行基因型分型；

9、若tmt1p5引物组和tmt1p6引物组均检测到对应碱基t，则判断该水稻不含抗稻曲病基因fsr1；若tmt1p5引物组和tmt1p6引物组均检测到对应碱基g，则判断该水稻含抗稻曲病基因fsr1；若tmt1p5引物组和tmt1p6引物组同时检测到碱基t和g，则待测材料含有杂合的fsr1基因。

10、进一步，所述荧光定量pcr扩增体系包含higeno 2x probe mix b、水稻gdna、扩增引物组和水。

11、进一步，所述荧光定量pcr扩增程序为：95℃预变性10min；95℃变性20s；61-55℃退火延伸40s，10个循环，每个循环降低退火延伸0.6℃；95℃变性20s；55℃退火延伸40s，34个循环。

12、本发明的有益效果：

13、本发明提供的的水稻稻曲病抗病基因fsr1的kasp分子标记是基于抗稻曲病基因fsr1在抗感品种的差异snp特异性设计的引物组。该分子标记可以快速对水稻品种中fsr1基因进行分型。本发明克服了稻曲病表型选择易受环境应的缺点，可以加快水稻抗稻曲病品种的选育进程。另一方面kasp分标记不依赖传统的凝胶电泳，可实现对fsr1基因的高通量检测。

技术特征：

1.水稻稻曲病抗病基因fsr1的kasp分子标记，其特征在于，该kasp分子标记包括tmt1p5引物组和tmt1p6引物组，所述tmt1p5引物组包括tmt1p5f1、tmtp5f2和tmtp5r，所述tmt1p5f1的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述tmtp5f2的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述tmtp5r的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述tmt1p6引物组包括tmt1p6f1、tmtp6f2和tmtp6r，所述tmt1p6f1的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述tmtp6f2的核苷酸序列如seq id no.5所示，所述tmtp6r的的核苷酸序列如seq id no.6所示。

2.一种检测水稻稻曲病抗病基因fsr1的引物组，其特征在于，该引物组包括tmt1p5引物组和tmt1p6引物组，所述tmt1p5引物组包括tmt1p5f1、tmtp5f2和tmtp5r，所述tmt1p5f1的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述tmtp5f2的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述tmtp5r的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述tmt1p6引物组包括tmt1p6f1、tmtp6f2和tmtp6r，所述tmt1p6f1的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述tmtp6f2的核苷酸序列如seqid no.5所示，所述tmtp6r的的核苷酸序列如seq id no.6所示。

3.含有如权利要求2所述引物组的水稻稻曲病抗病基因fsr1检测试剂盒。

4.如权利要求1所述的分子标记、权利要求2所述的引物组以及权利要求3所述的试剂盒在检测水稻稻曲病抗病基因fsr1中的应用。

5.一种水稻稻曲病抗病基因fsr1的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

6.如权利要求5所述的一种水稻稻曲病抗病基因fsr1的检测方法，其特征在于，所述荧光定量pcr扩增体系包含higeno 2x probe mix b、水稻gdna、扩增引物组和水。

7.如权利要求5所述的一种水稻稻曲病抗病基因fsr1的检测方法，其特征在于，所述荧光定量pcr扩增程序为：95℃预变性10min；95℃变性20s；61-55℃退火延伸40s，10个循环，每个循环降低退火延伸0.6℃；95℃变性20s；55℃退火延伸40s，34个循环。

技术总结
水稻稻曲病抗病基因FSR1的KASP分子标记及引物、试剂盒和应用，属于生物技术领域。本发明一方面提供了水稻稻曲病抗病基因FSR1的KASP分子标记，另一方面提供了利用该KASP分子标记进行水稻稻曲病抗病基因FSR1检测的应用。本发明克服传统抗病育种中稻曲病抗性表型选择易受环境影响的缺点，能够用于稻曲病抗病基因FSR1快速鉴定和稻曲病抗病育种辅助选择。

技术研发人员：寇艳君,邱结华,时焕斌
受保护的技术使用者：中国水稻研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/12/12