一种用于枣组培苗上的瞬时转基因的方法

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种用于枣组培苗上的瞬时转基因的方法。

背景技术：

1、gus基因是β-葡萄糖苷酸酶基因(β-glucuronidase)，是目前常用的一种报告基因。该基因的产物为β-葡萄糖苷酸酶，β-葡萄糖苷酸酶是一个水解酶，以β-葡萄糖苷酸酯类物质为底物，其反应产物可用多种方法检测出来，其中最为常用的检测方法是组织化学法，该方法以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸(x-gluc)作为反应底物，将实验材料用含有底物的缓冲液浸泡。在适宜的条件下，当实验材料的组织细胞转化了gus基因且发生表达时，用酒精洗脱之后，该酶就可将x-gluc水解生成蓝色物质，该物质可以反应具有gus活性的部位或位点，用肉眼或显微镜可以观测到。同时在一定程度下根据染色深浅可以观测gus表达水平。该检测方法简单、快速、灵敏、稳定且背景活性低，在研究外源基因瞬时表达的转化实验中广泛应用。

2、根癌农杆菌(agrobacterium tumefaciens)是革兰氏阴性土壤杆菌.自然情况下它可通过伤口侵入植物，将其t-dna序列转入植物细胞并整合到植物染色体上，利用这一原理可以得到快速表达外源基因的转基因植物。

3、枣为鼠李科(rhamnaleae)枣属(zizyphus)植物，原产于中国，由于其耐旱、耐瘠薄的特点，兼具经济、生态和社会等多重效益。近年来，关于枣的重要经济性状的分子生物学和基因工程研究逐渐深入，越来越多的功能基因被挖掘鉴定。枣作为多年生木本植物，已有将外源基因通过发根农杆菌介导法获得稳定转基因根系的报道，但是否能够诱导获得转基因植株尚存在一定的技术瓶颈，同时稳定转基因耗时长，且对品种具有选择性，尚不能广泛应用，使枣本体的基因功能验证还很困难，迫切需要建立一套快速且高效的基因功能验证体系。基于此，本发明构建了携带gus报告基因的农杆菌，通过农杆菌成功侵染枣组培苗，建立枣瞬时过表达基因体系，为枣功能基因组学研究及候选基因的快速筛选提供技术支持。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种用于枣组培苗上的瞬时转基因的方法，以解决上述现有技术存在的问题。利用本发明提供的方法法能够快速且高效地获得转基因植株。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明提供一种用于枣组培苗上的瞬时转基因的方法，包括利用携带有报告基因和目的基因的根癌农杆菌悬浮液侵染外植体，之后将侵染后的外植体转移至继代培养基中进行培养的步骤；

4、所述外植体包括枣组培苗、枣组培苗叶片或枣组培苗茎段。

5、优选的，所述侵染的方式为负压抽真空。

6、优选的，所述负压抽真空包括将所述外植体置于含有所述根癌农杆菌悬浮液的50ml注射器中，拉动活塞的步骤。

7、优选的，所述负压抽真空的时间为10-20min；所述拉动活塞的次数为5或10次。

8、优选的，所述根癌农杆菌悬浮液的od600为0.6或0.9；每支注射器中所述根癌农杆菌悬浮液的用量为20ml。

9、优选的，所述继代培养基包括以下浓度的组分：4.43g/l ms粉、30g/l蔗糖、0.5mg/l 6-ba、1mg/l 2,4-d、7g/l琼脂和300mg/l头孢霉素。

10、该继代培养基是一种适合菌液侵染后所得枣组培苗进行继代培养的培养基，能够在保证植株健康生长的基础上，还能够抑制根癌农杆菌的溢出。

11、优选的，所述培养包括暗培养和光暗交替培养；

12、所述暗培养的时间为24h，温度为25℃；所述光暗交替培养的黑暗时间为8h，光照时间为16h；所述光暗交替培养的时间为7d，温度为25℃。

13、优选的，所述枣组培苗包括酸枣组培苗和冬枣组培苗。

14、本发明公开了以下技术效果：

15、本发明提供一种用于枣组培苗上的瞬时转基因的方法，该方法通过构建含有gus报告基因的pgreen 62-sk过表达载体，将其导入农杆菌，经农杆菌介导转化枣组培苗的步骤。在侵染过程选择用无菌注射器进行负压抽真空试验，将含有重组质粒的农杆菌瞬时转染至枣苗组织中，之后将农杆菌介导侵染的枣组培苗25℃黑暗放置24h，光下培养7天后检测报告基因的gus染色的侵染效率，结果显示gus基因在枣组培苗不同组织中显著过表达。可见，该体系的建立有利于将来对枣进行调控不同组织发育基因的快速筛选和功能验证分析，而且利用该方法能够短时间内获得一种枣候选基因瞬时过表达体系。因此，该体系的建立有利于将来对植物进行基因快速筛选和功能验证分析，能够简单、高效、低成本鉴定枣基因功能。

16、同时本发明还提供了一套适合枣组培苗负压抽真空过表达转基因的最佳侵染体系，具体为：无菌条件下，将被侵染外植体放入无菌一次性注射器中，随后加入20ml根癌农杆菌悬浮液，使外植体完全浸泡在悬浮液中，用无菌过滤头和注射器乳头连接，拉动注射器活塞柄使注射器腔形成负压真空环境，1min后释放活塞柄，侵染液在压力作用下进入枣组织中，用滤纸将外植体表面悬浮液吸干，将外植体插入培养基，黑暗放置24h，光下培养7-10天后即可进行阳性植株的鉴定。利用注射器进行负压抽真空的技术，促进侵染进入枣组培苗组织中，提升侵染效率。本发明首次在枣组培苗中应用负压抽真空瞬时表达技术，为该技术在枣上的大规模应用奠定了基础，为枣基因功能的研究提供了便捷高效的工具。

技术特征：

1.一种用于枣组培苗上的瞬时转基因的方法，其特征在于，包括利用携带有报告基因和目的基因的根癌农杆菌悬浮液侵染外植体，之后将侵染后的外植体转移至继代培养基中进行培养的步骤；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述侵染的方式为负压抽真空。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述负压抽真空包括将所述外植体置于含有所述根癌农杆菌悬浮液的50ml注射器中，拉动活塞的步骤。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述负压抽真空的时间为10-20min；所述拉动活塞的次数为5或10次。

5.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述根癌农杆菌悬浮液的od600为0.6或0.9；每支注射器中所述根癌农杆菌悬浮液的用量为20ml。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述继代培养基包括以下浓度的组分：4.43g/l ms粉、30g/l蔗糖、0.5mg/l 6-ba、1mg/l 2,4-d、7g/l琼脂和300mg/l头孢霉素。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养包括暗培养和光暗交替培养；

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述枣组培苗包括酸枣组培苗和冬枣组培苗。

技术总结
本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种用于枣组培苗上的瞬时转基因的方法。本发明通过构建含有GUS报告基因的pGreen 62‑SK过表达载体，将其导入农杆菌，经农杆菌介导转化枣组培苗的步骤。在侵染过程选择用无菌注射器进行负压抽真空试验，将含有重组质粒的农杆菌瞬时转染至枣苗组织中，之后将农杆菌介导侵染的枣组培苗25℃黑暗放置24h，光下培养7天后检测报告基因的GUS染色效率，结果显示GUS基因在枣组培苗不同组织中显著过表达。可见，该体系的建立有利于将来对植物进行基因快速筛选和功能验证分析。本发明首次在枣组培苗中应用负压抽真空瞬时表达技术，为该技术在枣上的大规模应用奠定了基础。

技术研发人员：王会滨,王颖,魏戏梦,赵锦
受保护的技术使用者：河北农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5