酶解法结合乳酸菌发酵法制备澳洲坚果抗氧化肽的方法、澳洲坚果抗氧化肽及其应用

本发明涉及生物，尤其是涉及一种酶解法结合乳酸菌发酵法制备澳洲坚果抗氧化肽的方法、澳洲坚果抗氧化肽及其应用。

背景技术：

1、澳洲坚果(macadamia spp.)生长于澳大利亚东南部以及新南威尔东北部沿海地区的热带雨林中，属于山龙眼科(proteaceae)澳洲坚果种属(macadamiaf.muell.)，果仁蛋白含量丰富，包括七种人体必需氨基酸，其中leu与lys含量较高。leu具有调节中枢神经、大脑、肌肉以及参与蛋白质代谢的作用，lys可以促进胃蛋白酶分泌、钙的吸收及钙的积累，与其他植物蛋白相比，澳洲坚果蛋白还含有较高的arg、glu和asp，是一种颇有潜力的植物蛋白。澳洲坚果榨油后剩余的果粕，主要用于制作饲料，极大浪费了资源。果粕很好地保留了果仁的营养价值，含有25.9％的蛋白质、26.78％的碳水化合物和b族维生素等，具有很好的乳化作用。有研究者以澳洲坚果粕、奶粉、白砂糖、澳洲坚果油等为原辅料，在单因素实验基础上，通过正交试验优化澳洲坚果粕饼干的制作工艺，所得产品在色泽、香味、口感方面都表现出很好的品质特性；另外以澳洲坚果粕制成的果片产品，营养丰富、香味浓郁、口感好。澳洲坚果粕除了可直接用于加工食品外，还可用于一些活性物质的提取，例如，有研究者利用酶解法提取澳洲坚果粕中的蛋白质和多肽、利用弱碱水-醇沉的方法提取多糖，所提多糖具有较好的抗氧化能力。目前，全球澳洲坚果仍以初加工为主，且主要集中在果仁部分，果仁占所有产品类型的2/3，带壳坚果占1/3，其他产品仅占5％左右。随着澳洲坚果产业的不断发展，澳洲坚果资源日渐丰富，但对澳洲坚果各部分资源的利用尤其是对果粕的利用还处于初级阶段。因此，研究从澳洲坚果粕中制备生物活性肽的新方法和提取鉴定具有生物活性的多肽具有重要意义。

2、生物活性肽是由大约2-30个氨基酸组成的短肽，可以通过蛋白质降解产生，通常具有抗氧化、降血压和抑菌活性。roncero,alvarez和pardo(2020)也证明了坚果蛋白质是抗氧化肽的良好来源，富含必需氨基酸，近年来，人们对澳洲坚果中抗氧化肽的研究越来越感兴趣，许多研究结果表明，从澳洲坚果中制备生物活性肽的方法主要为酶解法，常用的水解酶有内源性酶(如胰蛋白酶、胃蛋白酶)和外源性酶，通过酶水解获得具有抗菌、抗炎和抗氧化活性等生物活性的澳洲坚果衍生肽。fu etal.(2023)对澳洲坚果果仁酶解液利用液相色谱-串联质谱技术(lc-ms/ms)进行鉴定并分析，筛选获得高抗氧化活性肽hllpk、keffp、keffpa，zhang et al.(2021)采用体外抗氧化模型和小鼠实验对澳洲坚果蛋白肽的抗氧活性进行综合评价，发现澳洲坚果蛋白肽具有较强的抗氧化活性。

3、然而目前对于澳洲坚果抗氧化肽的研究还不够完善，有待进一步研究。

4、有鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的第一目的在于提供一种酶解法结合乳酸菌发酵法制备澳洲坚果抗氧化肽的方法，该方法制备得到的澳洲坚果抗氧化肽的抗氧化活性好，以解决上述问题。

2、本发明的第二目的在于提供一种澳洲坚果抗氧化肽。

3、本发明的第三目的在于提供上述澳洲坚果抗氧化肽在制备抗氧化产品中的应用。

4、为了实现以上目的，特采用以下技术方案：

5、第一方面，本发明提供了一种酶解法结合乳酸菌发酵法制备澳洲坚果抗氧化肽的方法，包括以下步骤：

6、采用碱性蛋白酶对澳洲坚果粕进行酶解处理，然后采用植物乳杆菌zhang-ll对酶解处理后的澳洲坚果粕进行发酵，制备得到澳洲坚果抗氧化肽；

7、所述植物乳杆菌zhang-ll保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.6936。

8、需要说明的是，本发明所采用的植物乳杆菌zhang-ll为发明专利(cn201710127851.6)所公开的植物乳杆菌zhang-ll。

9、作为进一步技术方案，所述采用碱性蛋白酶对澳洲坚果粕进行酶解处理的步骤，包括：

10、配制澳洲坚果粕粉的水溶液，然后添加碱性蛋白酶进行酶解处理。

11、作为进一步技术方案，所述水溶液中澳洲坚果粕粉的质量浓度为6％-14％；

12、所述碱性蛋白酶的添加量为800-2400u/g；

13、所述酶解处理的ph为8.5-9.5，温度为45-55℃，时间为1.5-2.5h。

14、作为进一步技术方案，酶解处理后还包括碱性蛋白酶的灭活处理。

15、作为进一步技术方案，所述采用植物乳杆菌zhang-ll对酶解处理后的澳洲坚果粕进行发酵的步骤，包括：

16、将酶解处理后的澳洲坚果粕进行稀释，然后接种植物乳杆菌zhang-ll进行发酵。

17、作为进一步技术方案，所述稀释的料液比为1:1-1:2；

18、所述植物乳杆菌zhang-ll的接菌量为104-107cfu/ml；

19、所述发酵的时间为24-36h。

20、作为进一步技术方案，发酵结束后，还包括将发酵液进行分离纯化。

21、作为进一步技术方案，所述澳洲坚果抗氧化肽的氨基酸序列包括ldyl、lphq、pllk和rlye。

22、第二方面，本发明提供了一种澳洲坚果抗氧化肽，所述澳洲坚果抗氧化肽的氨基酸序列为ldyl、lphq、pllk或rlye。

23、第三方面，本发明提供了澳洲坚果抗氧化肽在制备抗氧化产品中的应用。

24、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

25、本发明提供的酶解法结合乳酸菌发酵法制备澳洲坚果抗氧化肽的方法，简单，成本低，制备得到的澳洲坚果抗氧化肽抗氧化活性高，该方法为天然抗氧化肽在澳洲坚果粕中的开发和应用提供重要的理论支持，有利于加快澳洲坚果产业的发展。对本发明方法获得的多肽进行鉴定，获得了四种具有良好抗氧化活性的多肽，为后续研究坚果抗氧化活性机理奠定了基础。

技术特征：

1.一种酶解法结合乳酸菌发酵法制备澳洲坚果抗氧化肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述采用碱性蛋白酶对澳洲坚果粕进行酶解处理的步骤，包括：

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述水溶液中澳洲坚果粕粉的质量浓度为6％-14％；

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，酶解处理后还包括碱性蛋白酶的灭活处理。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述采用植物乳杆菌zhang-ll对酶解处理后的澳洲坚果粕进行发酵的步骤，包括：

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述稀释的料液比为1:1-1:2；

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵结束后，还包括将发酵液进行分离纯化。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述澳洲坚果抗氧化肽的氨基酸序列包括ldyl、lphq、pllk和rlye。

9.一种澳洲坚果抗氧化肽，其特征在于，所述澳洲坚果抗氧化肽的氨基酸序列为ldyl、lphq、pllk或rlye。

10.权利要求9所述的澳洲坚果抗氧化肽在制备抗氧化产品中的应用。

技术总结
本发明提供了一种酶解法结合乳酸菌发酵法制备澳洲坚果抗氧化肽的方法、澳洲坚果抗氧化肽及其应用，涉及生物技术领域。本发明提供的酶解法结合乳酸菌发酵法制备澳洲坚果抗氧化肽的方法，包括：采用碱性蛋白酶对澳洲坚果粕进行酶解处理，然后采用植物乳杆菌Zhang‑LL对酶解处理后的澳洲坚果粕进行发酵，制备得到澳洲坚果抗氧化肽；植物乳杆菌Zhang‑LL的保藏编号为CGMCCNO.6936。该方法，简单，成本低，制备得到的澳洲坚果抗氧化肽抗氧化活性高。对本发明方法获得的多肽进行鉴定，获得了四种具有良好抗氧化活性的多肽，为后续研究坚果抗氧化活性机理奠定了基础。

技术研发人员：谢远红,张红星,常如菲,庞晓娜,金君华
受保护的技术使用者：北京农学院
技术研发日：
技术公布日：2024/11/14