一种具有抗氧化和抑菌活性的过氧化物还原酶6同源物及其制备与应用

本发明属于生物，涉及一种来源于克氏原螯虾(procambarus clarkii)的具有强抗氧化且结合细菌以及抑菌活性的过氧化物还原酶6同源物及其制备与应用。

背景技术：

1、在生物进化中，生物体经历了从无氧代谢到需氧代谢的过程。对需氧生物而言，生物体正常代谢会产生活性氧类物质(reactive oxygen species,ros)，主要包括超氧阴离子(o2-)、单线态氧(1o2)、羟自由基(oh)、过氧化氢(h2o2)等。细胞内产生的适当浓度的某些ros如h2o2是调节细胞分裂、细胞凋亡、免疫应答等生理过程的重要信号分子，同时也是引发病原微生物的蛋白质、脂质、核酸等生物大分子氧化损伤的重要免疫效应分子。需氧生物既需要使体内ros维持在适当水平，介导相关信号传递；又需要防止细胞内ros的过量产生，避免ros引发的氧化损伤。生物体抗氧化系统主要包括多种非酶类小分子组成的非酶促反应抗氧化系统和由多种抗氧化酶类组成的酶促反应抗氧化系统。

2、甲壳动物的体内抗氧化系统有几种关键酶起着重要作用。这些酶包括超氧化物歧化酶(sod)、过氧化氢酶(cat)和谷胱甘肽过氧化物酶(gpx)。它们的主要功能是消除活性氧，防止氧化损伤对细胞的伤害。过氧化物还原酶(peroxiredoxin，prx)蛋白质家族，是广泛分布于动物体内的抗氧化酶超家族，主要通过硫氧还蛋白(trx)作为氢的供体来消除过氧化氢，高效调节宿主体内ros水平，从而发挥抗氧化作用。过氧化物还原酶能够参与清除h2o2、过氧亚硝基、烷基氢过氧化物、脂质过氧化物、磷脂氢过氧化物等多种过氧化物。

3、prx分子首次由kim等人在酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)中鉴定，同时，发现它可以保护细胞免受活性氧的侵害。目前，已知哺乳动物prx家族主要有6种不同亚型，即prx1-6分子。根据起作用的半胱氨酸残基的数量与位置，分别称为典型2-cys prx、非典型2-cys prx和1-cys prx，研究结果显示不同亚型间prx的作用机制以及作用效果是不同的。

4、现有报道结果显示，prx分子除了主要发挥抗氧化功能之外，在传导过氧化物信号方面可能也具有补充作用，例如分子伴侣、保护膜免受损伤和维持铁稳态等作用以及参与血红素代谢、细胞的增殖分化、细胞信号传导及增强自然杀伤细胞的细胞毒活性等。

技术实现思路

1、本发明的首要目的在于提供一种来源于克氏原螯虾(procambarus clarkii)(又称淡水小龙虾)的具有强抗氧化性以及抑菌活性的过氧化物还原酶6同源物(isoform)。本发明的另一目的在于提供所述过氧化物还原酶6同源物的制备方法。本发明的再一目的在于提供所述过氧化物还原酶6同源物的应用。

2、本发明的目的通过下述技术方案实现：

3、一种来源于克氏原螯虾新的具有强抗氧化性以及抑菌活性的过氧化物还原酶6同源物，命名为pc-prx6 isoform(简写为pc-prx6i)蛋白质，其氨基酸序列如seq id no.1所示，具有219个氨基酸残基。

4、进一步地，克氏原螯虾体内，所述的过氧化物还原酶6同源物基因(命名为pc-prx6基因)的开放阅读框对应的核苷酸序列如seq id no.2所示，长660bp。

5、一种上述过氧化物还原酶6同源物的制备方法，包括如下步骤：

6、(1)以提取的克氏原螯虾总rna作为模板进行反转录pcr得到cdna。

7、(2)以步骤(1)获得的cdna作为模板进行pcr扩增获得含上述过氧化物还原酶6同源物编码序列(开放阅读框序列)的核苷酸片段，pcr扩增引物如下：

8、f：5’-nnatggttaacttaggcgat-3’，

9、r：5’-nnttactctggttgtggcgt-3’；

10、其中，nn由保护碱基和限制性内切酶酶切位点组成，n表示任意碱基，n为自然数(优选10～14)，可根据表达载体进行相应的调整。

11、(3)步骤(2)的扩增产物与原核表达载体通过酶切、连接、转化，构建可表达重组过氧化物还原酶6同源物的大肠杆菌工程菌。

12、(4)步骤(3)构建的大肠杆菌工程菌通过诱导培养，表达出重组过氧化物还原酶6同源物。

13、本发明对过氧化物还原酶6同源物在体外对核酸氧化降解的影响进行了试验，对金黄色葡萄球菌与鲶爱德华氏菌生长的影响进行了固体培养基抑菌试验和对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、鲶爱德华氏菌、哈维氏弧菌生长的影响进行了液体培养基抑菌实验，以及进行了细菌结合实验，结果显示本发明的过氧化物还原酶6同源物具有良好的抗氧化性，并具有很好的结合细菌以及抑菌生长的作用。因此，本发明的过氧化物还原酶6同源物具有在制备含有如下功效中的一种或多种的产品中的应用：抗氧化，抑制细菌，结合细菌，增强克氏原螯虾抗氧化能力，增强克氏原螯虾抗细菌能力；所述的细菌包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌；所述的产品的形式包括试剂、药物、化妆品、保健品等中的一种或多种。

14、一种产品，包含过氧化物还原酶6同源物，所述的产品为含有如下功效中的一种或多种的产品：抗氧化，抑制细菌，结合细菌，增强克氏原螯虾抗氧化能力，增强克氏原螯虾抗细菌能力；所述的细菌包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌；所述的产品的形式包括试剂、药物、化妆品、保健品等中的一种或多种。

15、本发明的优点和有益效果：本发明的过氧化物还原酶6同源物具有强的体外抗氧化活性，具有明显的抑菌作用。因此，其在开发成为增强生物的抗氧化能力以及由氧化引起的相关疾病，和结合细菌且抑制细菌生长的药剂试剂方面，具有良好的应用前景。

技术特征：

1.一种过氧化物还原酶6同源物，其特征在于：氨基酸序列如seq id no.1所示。

2.编码权利要求1所述的过氧化物还原酶6同源物的基因，其特征在于：所述的基因的开放阅读框的核苷酸序列如seq id no.2所示。

3.权利要求1所述的过氧化物还原酶6同源物的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

4.权利要求1所述的过氧化物还原酶6同源物在制备产品中的应用，其特征在于：所述产品为含有如下功效中的一种或多种的产品：抗氧化，抑制细菌，结合细菌，增强克氏原螯虾抗氧化能力，增强克氏原螯虾抗细菌能力。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的细菌包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的细菌包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、鲶爱德华氏菌、哈维氏弧菌。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的产品的形式包括试剂、药物、化妆品、保健品中的一种或多种。

8.一种产品，其特征在于：包含权利要求1所述的过氧化物还原酶6同源物；所述产品为含有如下功效中的一种或多种的产品：抗氧化，抑制细菌，结合细菌，增强克氏原螯虾抗氧化能力，增强克氏原螯虾抗细菌能力。

9.根据权利要求8所述的产品，其特征在于：所述的细菌包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。

10.根据权利要求8所述的产品，其特征在于：所述的产品包括试剂、药物、化妆品、保健品中的一种或多种。

技术总结
本发明公开了一种具有抗氧化和抑菌活性的过氧化物还原酶6同源物及其制备与应用，属于生物技术领域。本发明的过氧化物还原酶6同源物来源于克氏原螯虾，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其制备包括如下步骤：提取克氏原螯虾总RNA作为模板进行反转录获得cDNA；以cDNA为模板进行PCR扩增获得含过氧化物还原酶6同源物编码序列的核苷酸片段，扩增产物与表达载体通过酶切、连接、转化，获得大肠杆菌工程菌，通过诱导培养表达出重组过氧化物还原酶6同源物。本发明的重组过氧化物还原酶6同源物具有体外抗氧化活性和抑菌作用，其在开发成为增强生物的抗氧化能力、结合和抑制细菌生长的药剂试剂方面，具有良好的应用前景。

技术研发人员：杜志强,张明达,于洋,李甜甜,董彬
受保护的技术使用者：内蒙古科技大学
技术研发日：
技术公布日：2024/11/26