紫草素在体外诱导活化型树突状细胞中的应用及方法

本发明属于树突状细胞培养，具体涉及一种紫草素在体外诱导活化型树突状细胞中的应用及方法。

背景技术：

1、公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

2、胃癌( gastric cancer，gc) 是全球第5大常见的恶性肿瘤，死亡率位居第4。近10年来，免疫疗法的快速发展为胃癌患者带来了新的希望，特别是肿瘤疫苗疗法，成为该领域的一颗新星。疫苗疗法能够激发特异性淋巴细胞的增加，引发对肿瘤抗原的强烈免疫应答。相较于传统治疗，免疫疗法毒性低、疗效持久、有助于长期生存。树突状细胞（dendriticcells，dc）的肿瘤疫苗是目前最有潜力的类型之一，其在多种肿瘤的初步试验中都取得了较为理想的效果。

3、dc是激活适应性免疫的关键，不仅具有免疫协调作用，清除外来入侵病毒、细菌等微生物感染，而且在稳定状态下可调节免疫系统、诱导免疫耐受，从而维持免疫系统平衡。诱导其功能状态的改变成为免疫治疗的一项重要的策略。分离出的dc通常需要与细胞因子共培养以达到成熟状态，有研究表明在体外利用激动剂活化dc，可更有效激活效应细胞进入肿瘤微环境，并对肿瘤进行杀伤。如果缺乏有效的dc激活佐剂可能会导致dc保持未激活状态或诱导耐受，从而导致dc疫苗效果不佳。相关抗体或者激动诱导剂可以诱导dc成熟活化，从而更有利于用于肿瘤的治疗。但某些激活诱导剂会形成免疫抑制的肿瘤微环境，产生免疫抑制作用，不利于疫苗后续的免疫效应。

4、紫草素（shikonin，sk）是我国传统中药紫草的有效成分之一，主要活性成分为阿卡宁，分子式c16h16o5，具有抗肿瘤、抗炎、抗糖尿病、免疫调节等多种作用。目前，关于紫草素体外诱导活化型dc的方法还未见报道。

技术实现思路

1、为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供紫草素在体外诱导活化型树突状细胞中的应用及方法，本发明利用紫草素通过体外诱导培养活化型dc，从而得到高活性、具有强免疫功能的活化型dc，用于治疗胃癌。

2、为了实现上述目的，本发明的技术方案为：

3、本发明的第一个方面，提供紫草素在体外诱导活化型树突状细胞中的应用。

4、在本发明的一些实施例中，所述活化型树突状细胞具有如下一种或多种功能：

5、（1）高表达共刺激分子cd80、cd86；

6、（2）与t细胞共培养，促进il-12p70、ifn-γ和tnf-α因子的分泌；

7、（3）与t细胞共培养，促进t细胞向th1、th17方向转化；

8、（4）与t细胞共培养，加强t细胞对胃癌细胞的杀伤能力。

9、本发明的第二个方面，提供一种紫草素体外诱导活化型树突状细胞的方法，包括如下步骤：

10、获得外周血单个核细胞，培养获得树突状细胞前体细胞；

11、加入细胞因子培养至树突状细胞前体细胞分化为树突状细胞；

12、加入紫草素诱导树突状细胞分化为活化型树突状细胞。

13、在本发明的一些实施例中，所述获得外周血单个核细胞包括如下步骤：

14、采集外周血并稀释、分离，得到外周血单个核细胞。

15、在本发明的一些实施例中，所述外周血单个核细胞用含有10-15%自体灭活血浆的1640培养基培养。可以理解的，所述自体灭活血浆为和培养诱导的细胞同源的血浆。

16、在本发明的一些实施例中，所述细胞因子为il-4和gm-csf；

17、加入细胞因子后，il-4的浓度为500 u/ml，gm-csf的浓度为1000 u/ml。

18、在本发明的一些实施例中，加入紫草素后，紫草素的浓度为1.4-1.5 μg/ml。

19、在本发明的一些实施例中，所述方法还包括：收集活化型树突状细胞，经冷冻液处理后，冷冻保存。

20、其中，所述冷冻液按质量百分数计，包括10%dmso、90%fbs。活化型树突状细胞在冷冻液中的浓度为2×106/ml。收集的活化型树突状细胞与冷冻液处理后，分装入冻存管或冷冻袋中液氮-196℃下保存。

21、本发明的第三个方面，提供一种活化型树突状细胞，所述活化型树突状细胞通过所述的紫草素体外诱导活化型树突状细胞的方法制得；

22、所述活化型树突状细胞具有如下一种或多种功能：

23、（1）高表达共刺激分子cd80、cd86；

24、（2）与t细胞共培养，促进il-12p70、ifn-γ和tnf-α因子的分泌；

25、（3）与t细胞共培养，促进t细胞向th1、th17方向转化；

26、（4）与t细胞共培养，加强t细胞对胃癌细胞的杀伤能力。

27、本发明的第四个方面，提供一种所述的活化型树突状细胞在制备治疗胃癌药物中的应用。

28、本发明所制备的活化型树突状细胞具有较强的免疫功能，可以作为一种活化型树突状细胞制品应用，可用于治疗胃癌。

29、本发明的有益效果为：

30、本发明发现紫草素可以激活dc。紫草素诱导的活化型dc高表达cd80、cd86；与lps诱导的活化型dc相比，能上调th1/th17比值，增强t细胞对胃癌细胞的杀伤能力，抗肿瘤作用强；能有效激活t细胞，具有杀伤肿瘤细胞作用；对dc本身稳定性及活性也比较好。

31、本发明提供了一种诱导外周血单核来源的树突状细胞活化的体外培养方法，利用紫草素体外诱导培养活化型dc，可以从外周血中获得高活性、强免疫功能的活化型dc，这种dc可以在液氮中保存。通过本发明的方法诱导培养或低温保存后复苏的活化型dc具有较好的活性，能够治疗胃癌，这将有益于胃癌的治疗。

技术特征：

1.紫草素在体外诱导活化型树突状细胞中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述活化型树突状细胞具有如下一种或多种功能：

3.一种紫草素体外诱导活化型树突状细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：

4.如权利要求3所述的紫草素体外诱导活化型树突状细胞的方法，其特征在于，所述获得外周血单个核细胞包括如下步骤：

5.如权利要求3所述的紫草素体外诱导活化型树突状细胞的方法，其特征在于，所述外周血单个核细胞用含有10-15%自体灭活血浆的1640培养基培养。

6.如权利要求3所述的紫草素体外诱导活化型树突状细胞的方法，其特征在于，所述细胞因子为il-4和gm-csf；

7.如权利要求3所述的紫草素体外诱导活化型树突状细胞的方法，其特征在于，加入紫草素后，紫草素的浓度为1.4-1.5 μg/ml。

8.如权利要求3所述的紫草素体外诱导活化型树突状细胞的方法，其特征在于，所述方法还包括：收集活化型树突状细胞，经冷冻液处理后，冷冻保存。

9.一种活化型树突状细胞，其特征在于，所述活化型树突状细胞通过权利要求3-8任一所述的方法制得；

10.一种权利要求9所述的活化型树突状细胞在制备治疗胃癌药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种紫草素在体外诱导活化型树突状细胞中的应用及方法，属于树突状细胞培养技术领域。本发明发现紫草素可以激活DC。紫草素诱导的活化型DC高表达CD80、CD86；与LPS诱导的活化DC相比，能上调Th1/Th17比值，增强T细胞对胃癌细胞的杀伤能力，抗肿瘤作用强；能有效激活T细胞，具有杀伤肿瘤细胞作用；对DC本身稳定性及活性也比较好。本发明利用紫草素体外诱导培养活化型DC，从外周血中获得高活性、强免疫功能的活化型DC，这种DC可以在液氮中保存。通过本发明的方法诱导培养或低温保存后复苏的活化型DC具有较好的活性，能够治疗胃癌。

技术研发人员：林玮,杨依,张敏,魏勋斌
受保护的技术使用者：山东第一医科大学（山东省医学科学院）
技术研发日：
技术公布日：2024/10/31