一种萝卜的遗传转化方法

本发明涉及植物转基因，更具体的涉及一种萝卜的遗传转化方法。

背景技术：

1、萝卜又名莱菔、芦菔，是十字花科萝卜属的二年生草本植物，在中国栽培历史悠久的大众化蔬菜。萝卜肉质根作为主要的食用器官，富含多种营养物质，包括碳水化合物、维生素、无机盐及芥子油等。萝卜可以用来煲汤、制作泡菜、压榨油等。除了作为食材，萝卜还具有悠久的药用历史，根据相关史料记载，萝卜的药用历史已超过1500多年，《本草纲目》对萝卜的描述：该品味辛、甘，性凉，入肺胃经，为食疗佳品，可以治疗或辅助治疗多种疾病，被称之为“蔬中最有利者”。其中，萝卜的拉丁名为raphanus sativus l.。

2、leafycotyledon基因简写为lec基因，lec基因有lec1和lec2两种类型。有科学家在拟南芥中发现，其突变会导致胚胎死亡或发育异常。lec2基因编码一个转录因子，它可以结合到dna序列上，调节其他基因的表达，lec2基因的表达受到多种因素的调控，包括光照、激素、营养等。lec2基因在拟南芥的发育过程中直接或间接地调控了大量与种子发育有关的基因的表达，主要表达在胚乳和胚珠中，其在胚乳中的表达水平直接影响着种子的大小和形态，其编码的蛋白质可以调控植物的种子发育和营养物质的合成。lec2基因对胚胎发育具有关键作用，其主要功能包括控制胚乳的转化、胚胎营养物质的合成和油脂的积累。在胚胎发育早期，lec2基因可以调控seed storage protein基因的表达，促进胚乳中蛋白质的积累。同时，lec2基因还可以调控油脂代谢途径中的多个关键基因的表达，如acetyl-coacarboxylase、ketoacyl-acyl carrier protein synthaseⅱ等，从而促进油脂的合成和积累。除了在胚胎发育中的作用外，lec2基因还在植物的幼苗期和成熟期中发挥重要作用。在幼苗期，lec2基因可以调控休眠种子的萌发和胚芽的生长发育；在成熟期，lec2基因则可以促进植物的油脂积累和代谢。其中，lec的全称为leafy cotyledon。lec1的全称为leafycotyledon 1。lec2的全称为leafy cotyledon 2。拟南芥的拉丁名为arabidopsisthaliana。seed storage protein的简称为ssp。acetyl-coa carboxylase的简称为acc。ketoacyl-acyl carrierprotein synthaseⅱ的简称为kasⅱ。

3、萝卜是一种常见的蔬菜作物，具有重要的经济价值和药用价值。根据大量研究表明萝卜是极难再生的植物，近年许多研究者为萝卜遗传转化体系的建立作了大量的研究，但至今没有成熟的萝卜遗传转化体系。目前，萝卜遗传转化体系中依赖于组织培养。因此，有必要开发一种不依赖于组织培养的遗传转化体系。

技术实现思路

1、本发明提供一种萝卜的遗传转化方法，用以解决现有技术中萝卜遗传转化体系中依赖于组织培养的问题。

2、第一方面，本发明提供了一种萝卜的遗传转化方法，包括如下步骤：

3、低温培养获得健壮的萝卜幼苗：萝卜种子萌发后，于2.5℃～5.5℃低温培养9天～16天，进行春化处理，获得幼苗期萝卜植株。

4、培养携带目的基因的农杆菌，离心后重悬，得到农杆菌侵染液。

5、将所述农杆菌侵染液注射于幼苗期萝卜植株的顶端分生组织，培养至苗期，经pcr快速鉴定，得到t0代转基因植株。

6、本发明提供的一种萝卜的遗传转化方法，建立了高效的萝卜遗传转化体系。本发明提供的该方法不依赖于组织培养及基因型，能够解决现有技术中萝卜遗传转化体系中依赖于组织培养的问题。

7、作为一种可能的实现方式，所述萝卜种子培养至萌发的培养条件为：25℃～28℃培养1天～2天。

8、作为一种可能的实现方式，低温培养的条件为：3℃～5℃低温培养9天～16天。

9、作为一种可能的实现方式，萝卜种子萌发的培养条件为25℃～28℃培养1天～2天。

10、作为一种可能的实现方式，所述农杆菌侵染液的od600为0.1～0.5。

11、作为一种可能的实现方式，所述农杆菌侵染液的注射剂量为0.2ml～1ml/株。

12、作为一种可能的实现方式，注射采用微型注射器，所述微型注射器的针头规格为0.2×15-1.0×15twlb。

13、第二方面，本发明要求保护结合第一方面制备得到的转基因萝卜。

14、作为一种可能的实现方式，所述转基因萝卜包括atlec2基因，所述atlec2基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

15、作为一种可能的实现方式，所述转基因萝卜为t0代或，t0代自交或杂交产生的后代。

16、本发明通过拟南芥中克隆lec2基因，构建了pcambia1302-35s-gfp-atlec2表达载体，利用微型注射器将携带atlec2基因的农杆菌侵染液注射到萝卜幼苗顶端分生组织，得到转基因萝卜，建立了高效的萝卜遗传转化体系。本发明进一步通过pcr检测转基因植株并计算出转化率，将转基因阳性植株和对照分别进行荧光定量pcr，确认转基因是否成功，证明了本发明提供的转化体系在t0代得到了转基因植株，且转化率较高。

17、本发明采用注射法，提供了一种不依赖于组织培养及基因型的萝卜遗传转化体系

18、本发明提供了一种转化率高达82％的的萝卜遗传转化方法，有效提高萝卜转基因的成功率。

19、本发明通过低温处理一是可以注射更多菌液，提高转化率，二是通过春化处理促进萝卜苗提早开花结果，缩短转基因植株加代时间。

20、本发明提供的一种简洁、快速、方便、不依赖于组织培养的萝卜遗传转化方法，有利于促进萝卜分子生物学研究及遗传育种。

技术特征：

1.一种萝卜的遗传转化方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述萝卜种子培养至萌发的培养条件为：25℃～28℃培养1天～2天。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，低温培养的条件为：3℃～5℃低温培养9天～16天。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，萝卜种子萌发的培养条件为25℃～28℃培养1天～2天。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述农杆菌侵染液的od600为0.1-0.5。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述农杆菌侵染液的注射剂量为0.2ml/株～1ml/株。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，注射采用微型注射器，所述微型注射器的针头规格为0.2×15twlb～1.0×15twlb。

8.权利要求1～7任一项所述方法制备得到的转基因萝卜。

9.根据权利要求8所述的转基因萝卜，其特征在于，所述转基因萝卜为t0代或，t0代自交或杂交产生的后代。

技术总结
本发明公开了一种萝卜的遗传转化方法，属于植物转基因技术领域，解决了现有技术中萝卜遗传转化体系中转化率低的问题。该转化方法包括如下步骤：幼苗的培养及低温处理，培养携带目的基因的农杆菌，离心后重悬，得到农杆菌侵染液；将农杆菌悬浮液注射于幼苗期萝卜植株的顶端分生组织，培养至苗期，通过PCR快速鉴定候选转基因植株，得到T<subgt;0</subgt;代阳性转基因植株。本发明提供的方法，高效地实现了萝卜在T<subgt;0</subgt;代的遗传转化。

技术研发人员：陈发波,高健,方平,田璐瑶,王青
受保护的技术使用者：长江师范学院
技术研发日：
技术公布日：2024/12/30