一种根据tRNA表达特征提升蛋白质生物合成效率的方法

本发明属于生物技术，具体涉及一种根据trna表达特征提升蛋白质生物合成效率的方法。

背景技术：

1、蛋白质是承担生命活动的主要功能分子，其合成过程被称为翻译。该过程以mrna作为模板并在核糖体的参与下，通过trna将mrna上的核苷酸序列转变为对应的氨基酸序列，从而合成多肽链。蛋白质翻译是生物体生长、发育和维持生命活动的基础，其翻译效率是细胞调控基因表达的重要手段之一，受多种因素调节。在蛋白质翻译过程中，密码子的使用通过翻译依赖和翻译不依赖的机制在调节基因表达和蛋白质结构方面发挥着多重作用。同义密码子被同源trna识别的效率不同，在不同的真核生物和原核生物中，密码子使用偏差与同源trna水平或trna基因拷贝数相关(doi:10.1186/s12964-020-00642-6)。因此，密码子的选择会影响翻译效率。

2、现已确定在mrna翻译延伸过程中，密码子在调节翻译速率方面扮演着重要的角色(doi:10.1146/annurev-biochem-052621-091808)。通常，采用宿主偏好的密码子能够有效提升核糖体的翻译速率与效率，进而减少翻译过程中的停滞现象；相对而言，稀有密码子的使用则可能导致核糖体在mrna上的停滞，从而可能会造成翻译的提前终止(doi:10.1126/science.aad9868)。密码子最优性在翻译效率水平上影响基因表达，富集最优密码子和非最优密码子的报告子在蛋白质水平上的差异往往大于rna水平上的差异(doi:10.1038/s41598-020-74091-z)。故通过密码子优化可以增加多种真核生物和原核生物内源和外源蛋白的翻译效率，显著提高mrna的稳定性和蛋白质的高效大量表达。

3、密码子优化的基本原则就是用宿主细胞中使用频率高的同义密码子去替换稀有密码子，以适应宿主细胞的偏好，从而优化翻译过程。事实上，大量研究表明trna的相对丰度和可用性是翻译效率的限速步骤，对密码子介导的稳定性动力学有影响。trna的表达具有组织特异，任何给定密码子的调控特性都可能根据trna可用性的条件和组织特异性差异而变化(72-74)。因此，trna的相对丰度对密码子优化是一个不可忽视的因素。而传统密码子优化方法是以密码子适应性指数(codon adaptation index，cai)为重要指标，同时考虑mrna二级结构和gc含量等因素进行优化目标基因的密码子序列。没有过多的考虑不同组织和细胞中trna的丰度变化。为此，本发明提出一种根据trna表达特征提升蛋白质生物合成效率的优化方法。

4、密码子优化是指通过改变mrna序列中的密码子，使其更适合宿主细胞的密码子使用偏好，从而提高蛋白质的翻译效率。传统密码子的优化策略就是用宿主细胞中使用频率高的同义密码子去替换外源mrna序列中的稀有密码子，通过使用一系列定量方法来产生不同的mrna序列，用以减少核糖体在mrna上寻找匹配trna的时间，从而提升翻译速率。其做法是以计算原始氨基酸序列在宿主细胞中密码子适应性指数(codon adaptation index，cai)为主要指标并同时兼顾mrna二级结构以及gc含量等优化指标对目标基因的密码子序列进行优化，以期提高其在翻译过程中的速度和效率。虽然传统密码子优化策略简单易行，但其存在一定的缺陷和不足：

5、(1)传统方法通常以cai作为密码子优化的主要指标，仅针对稀有密码子进行替换，无法全面考虑密码子使用频率、mrna结构、trna丰度等多重因素，因此优化效果有限；

6、(2)优化后的序列含有宿主偏性密码子，因此转录的mrna含有较高比例的密码子亚群，从而导致不同trna的失衡，最终使得trna的消耗和翻译的终止；

7、(3)传统方法未考虑不同宿主细胞对密码子的偏好性不同，优化方式缺乏通用性。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：

2、本发明提供一种根据trna表达特征提升蛋白质生物合成效率的方法，所述方法包含以下步骤：

3、(1)构建样本的trna-seq文库；

4、(2)数据分析；

5、计算转运相同类型的氨基酸的trna所占各自比例，选取将同一同型trna中表达量最高的同工受体trna对应的密码子定义为高rsau密码子；

6、(3)密码子优化

7、将待表达基因序列中低rsau密码子替换成高rsau密码子。

8、优选地，所述步骤(1)中构建trna-seq文库具体包括trna的分离、预处理、双接头连接以及cdna的合成和文库扩增。

9、优选地，所述步骤(2)中所述rsau的计算公式如下：

10、

11、优选地，在步骤(1)中样本为人类胚胎肾细胞系293t。

12、优选地，在步骤(2)中所述高rsau密码子分别为gct、agg、aac、gac、tgc、gag、cag、ggc、cac、att、ctg、aag、atg、ttc、cct、agc、aca、tgg、tac、gtg。

13、本发明的有益效果：

14、(1)优化密码子偏好性，提高同工trna使用效率，平衡密码子和trna浓度，提高翻译效率；

15、(2)考虑不同宿主的同工trna的表达量，使密码子更适应宿主细胞环境；

16、(3)不仅替换稀有密码子，还考虑trna丰度，实现更全面的密码子优化。

技术特征：

1.一种根据trna表达特征提升蛋白质生物合成效率的方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中构建trna-seq文库具体包括trna的分离、预处理、双接头连接以及cdna的合成和文库扩增。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中所述rsau的计算公式如下：

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中样本为人类胚胎肾细胞系293t。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中所述高rsau密码子分别为gct、agg、aac、gac、tgc、gag、cag、ggc、cac、att、ctg、aag、atg、ttc、cct、agc、aca、tgg、tac、gtg。

技术总结
本发明属于生物技术技术领域，具体涉及一种根据tRNA表达特征提升蛋白质生物合成效率的方法。本发明提供一种根据tRNA表达特征提升蛋白质生物合成效率的方法，所述方法包含以下步骤：(1)构建样本的tRNA‑seq文库(2)选取将同一同型tRNA中表达量最高的同工受体tRNA相应的密码子定义为高RSAU密码子；(3)将高RSAU密码子替换待表达基因序列中低RSAU密码子。本发明的有益效果：(1)优化密码子偏好性，提高同工tRNA使用效率，平衡密码子和tRNA浓度，提高翻译效率；(2)考虑不同宿主的同工tRNA的表达量，使密码子更适应宿主细胞环境；(3)不仅替换稀有密码子，还考虑tRNA丰度，实现更全面的密码子优化。

技术研发人员：王奕蓉,于峰,程慧敏,蔡子欣,舒淙瑶
受保护的技术使用者：湖南大学
技术研发日：
技术公布日：2025/1/2