一种利用葡萄糖二次母液制备葡萄糖结晶的方法

本发明涉及生物工程，尤其是指一种利用葡萄糖二次母液制备葡萄糖结晶的方法。

背景技术：

1、淀粉是由葡萄糖脱去一分子水后经糖苷键连接形成的共价聚合物，是一种高分子糖类。其基本构成单元为α-d-葡萄糖。淀粉主要分为直链淀粉和支链淀粉两类，脱水葡萄糖经α-1,4-糖苷键连接的被称为直链淀粉，支链淀粉的分子结构比直链淀粉更为复杂，其主要是以α-1,4-糖苷键连接的主链，同时在分支点由α-1,6-糖苷键连接成多个分支结构。

2、淀粉制糖发展历史悠久，将淀粉原料经过酸法或者酶法等制取的各种糖类，如葡萄糖、麦芽糖、低聚糖和果葡糖浆等，统称为淀粉糖。葡萄糖是一种在自然界分布广泛的单糖，工业上生产葡萄糖主要采用双酶法，即淀粉经过α-淀粉酶液化后再添加葡萄糖淀粉酶进行糖化反应。淀粉酶是指能作用于淀粉的酶，淀粉酶主要水解淀粉分子中糖苷键，目前工业上淀粉糖生产中使用的酶主要有：α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和脱支酶等。其中脱支酶主要水解淀粉或者大分子糖原中的α-1,6-糖苷键，根据其对底物的特异性不同，将脱支酶分成支链淀粉酶、异淀粉酶和低聚糖脱支酶。葡萄糖淀粉酶主要作用淀粉中α-1,4-糖苷键，对α-1,6-糖苷键的水解效率非常缓慢；同时葡萄糖淀粉酶还具有转糖苷活力，在糖化反应后期葡萄糖浓度较高时催化葡萄糖聚合生成由α-1,6-糖苷键组成的异麦芽低聚糖。因此单一使用糖化酶时淀粉水解不够彻底，副产物较多。

3、为了得到高纯度葡萄糖浆，可以在糖化反应中复配使用脱支酶，脱支酶负责水解底物中的分支点，为糖化酶提供更易水解的线性底物，加快糖化反应速度，减少副产物生成，提高葡萄糖得率和纯度。支链淀粉酶对相对分子质量较小的糊精和普鲁兰多糖脱支效率高，对大分子淀粉脱支效率低。部分普鲁兰酶存在α-1,4-糖苷键水解活力，易产生较多副产物。异淀粉酶对相对分子质量较大的支链淀粉以及分支密集的糖原脱支效率高，对小分子麦芽糊精脱支效率低。低聚糖脱支酶(oligo-1,6-glucosidase；ec 2.4.1.10)是一种能够水解低聚糖分子间的α-1,6-糖苷键，进而生成更多的小分子糖，但在工业上还亟需一种能够水解小分子糖分子间的α-1,4-糖苷键的低聚糖脱支酶，以满足工业上对麦芽低聚糖和异麦芽低聚糖水解的需求。目前的研究中低聚糖脱支酶大多是大肠杆菌表达系统且几乎都在胞内表达，这种表达系统获取酶液困难、步骤繁琐，效率低下，严重阻碍了低聚糖脱支酶的大规模工业化应用。枯草芽孢杆菌是一种在自然界普遍存在的革兰氏阳性菌，由于其独特的生理优势和食品级工程菌的身份，在多个产业如食品、农业、环境和生物里被广泛的使用。

4、在葡萄糖工业化生产工艺中，结晶的葡萄糖从结晶罐中分离出后剩余的反应液被称为葡萄糖母液，根据葡萄糖结晶次数的不同，可以将其分为一次母液、二次母液和色谱提余液。其中，一次母液会再次回到结晶罐再次结晶，但二次母液由于其葡萄糖含量低、二糖和三糖等小分子糖含量高而难以再次结晶，通常会将其出售，但由于每次结晶后会产生大量葡萄糖母液，导致葡萄糖母液价格偏低，市场价值受限，这与对废弃物充分利用的循环绿色的理念相悖。在葡萄糖结晶过程中，葡萄糖母液中可能残留些许色素和杂质，这些成分对最终产品的质量有着直接的影响。通过监测电导率的变化可以了解溶液中无机盐等杂质的含量，通常，较高的电导率意味着有较多的无机盐杂质存在，这会影响葡萄糖晶体的纯度。

5、所以，如何充分利用葡萄糖母液中各种小分子糖、提高葡萄糖母液综合利用率与经济价值、提升葡萄糖结晶的纯度和品质是目前亟需解决的问题。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供了一种利用葡萄糖二次母液制备葡萄糖结晶的方法，以枯草芽孢杆菌wb600作为底盘菌株，以pp43nmk作为表达载体，异源表达低聚糖脱支酶突变体，突变体为将seq id no.1所示氨基酸的第219位缬氨酸突变为丙氨酸，得到胞外表达产物用于处理二次提取葡萄糖结晶后的残留液体，经过处理的葡萄糖二次母液中小分子糖的含量下降，葡萄糖的含量上升，用于再次结晶获得一水葡萄糖。

2、本发明的第一个目的是提供一种利用葡萄糖二次母液制备葡萄糖结晶的方法，使用低聚糖脱支酶突变体处理葡萄糖二次母液，所述葡萄糖二次母液为二次提取葡萄糖结晶后的残留液体，所述低聚糖脱支酶突变体由seq id no.1所示氨基酸序列的第219位缬氨酸突变为丙氨酸得到，由枯草芽孢杆菌异源表达。

3、进一步地，还包括脱盐、脱色、抽滤、浓缩、冷却和干燥的步骤。

4、进一步地，所述枯草芽孢杆菌以pp43nmk为表达载体。

5、进一步地，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌wb600。

6、进一步地，所述处理的时间为0-48小时。

7、优选地，所述处理的时间为24小时。

8、进一步地，所述葡萄糖二次母液的ph值为5-7。

9、优选地，所述葡萄糖二次母液的ph值为6。

10、进一步地，所述葡萄糖二次母液中底物的质量浓度为10-50％。

11、优选地，所述葡萄糖二次母液中底物的质量浓度为40％。

12、进一步地，所述低聚糖脱支酶突变体的添加量为0-50u/g。

13、优选地，所述低聚糖脱支酶突变体的添加量为30u/g。

14、本发明的第二个目的是提供一种重组枯草芽孢杆菌，所述重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌wb600为表达宿主，以pp43nmk为表达载体，异源表达低聚糖脱支酶突变体，所述低聚糖脱支酶突变体由seq id no.1所示氨基酸序列第219位缬氨酸突变为丙氨酸得到。

15、本发明的第三个目的是提供包含上述重组枯草芽孢杆菌的微生物菌剂。

16、上述重组枯草芽孢杆菌或上述微生物菌剂在利用葡萄糖二次母液制备葡萄糖结晶中的应用。

17、本发明的有益效果：

18、本发明通过基因工程的手段，将低聚糖脱支酶通过枯草芽孢杆菌系统进行高效分泌表达，降低了获取难度，简化酶的提取流程，为低聚糖脱支酶的工业化应用奠定坚实的物质基础。将低聚糖脱支酶突变体应用于处理葡萄糖二次母液，并使用处理过的葡萄糖二次母液再次结晶获得一水葡萄糖，产物脱色率和结晶率都得到提升，能够有效解决现有技术中葡萄糖二次母液利用率低，市场价值受限的问题，具有良好的工业应用前景。

技术特征：

1.一种利用葡萄糖二次母液制备葡萄糖结晶的方法，其特征在于：使用低聚糖脱支酶突变体处理葡萄糖二次母液，所述葡萄糖二次母液为二次提取葡萄糖结晶后的残留液体，所述低聚糖脱支酶突变体由seq id no.1所示氨基酸序列的第219位缬氨酸突变为丙氨酸得到，由枯草芽孢杆菌异源表达。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌以pp43nmk为表达载体。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌wb600。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述处理的时间为0-48小时。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述葡萄糖二次母液的ph值为5-7。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述葡萄糖二次母液中底物的质量浓度为10-50％。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述低聚糖脱支酶突变体的添加量为0-50u/g。

8.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌wb600为表达宿主，以pp43nmk为表达载体，异源表达低聚糖脱支酶突变体，所述低聚糖脱支酶突变体由seq id no.1所示氨基酸序列第219位缬氨酸突变为丙氨酸得到。

9.包含权利要求8所述重组枯草芽孢杆菌的微生物菌剂。

10.权利要求8所述的重组枯草芽孢杆菌或权利要求9所述的微生物菌剂在利用葡萄糖二次母液制备葡萄糖结晶中的应用。

技术总结
本发明涉及一种利用葡萄糖二次母液制备葡萄糖结晶的方法，属于生物工程技术领域。本发明以枯草芽孢杆菌WB600作为底盘菌株，以pP43NMK作为表达载体，异源表达低聚糖脱支酶突变体，突变体为将SEQ ID NO.1所示氨基酸的第219位缬氨酸突变为丙氨酸，得到胞外表达产物用于处理二次提取葡萄糖结晶后的残留液体，经过处理的葡萄糖二次母液中小分子糖的含量下降，葡萄糖的含量上升，用于再次结晶获得一水葡萄糖，产物脱色率和结晶率都得到提升，能够有效解决现有技术中葡萄糖二次母液利用率低，市场价值受限的问题，具有良好的工业应用前景。

技术研发人员：李兆丰,孙昊,顾正彪,李才明,孔昊存
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/12/30