一种基于RAA-CRISPR-Cas13a快速精准检测新型鸭正呼肠孤病毒的方法及应用

本发明属于生化与分子生物学，涉及一种基于raa-crispr-cas13a酶分子系统的新型鸭正呼肠孤病毒检测方法及应用。

背景技术：

1、新型鸭正呼肠孤病毒(ndrv)近年来在我国大面积流行，是一种以脾脏肿大、出血、坏死为主要特征的免疫抑制病，给水禽养殖业带来了严重危害。ndrv基因组全长超23kb，包含10个基因节段，常因点突变积累和基因重组发生病毒基因组遗传变异。如何从庞大的ndrv基因组序列中选择适合的区域作为检测靶标，对于特异性、高效率检测ndrv是十分关键的。

2、ndrv的s1基因为多顺反子结构，含有3个开放阅读框，编码p10、p17和σc蛋白，其中，σc是ndrv的重要结构蛋白，在ndrv病毒感染过程中，σc蛋白单体被活化形成同源三聚体发挥作用，并可诱导宿主产生特异性中和抗体，是一种重要的毒力因子和保护性抗原，同时，在持续的免疫选择压力下，σc蛋白编码基因是最易发生基因变异的基因节段，也是ndrv区别于此前流行毒株的重要基因节段。因此，针对σc蛋白进行研究是ndrv病毒特异性检测的关键点。

3、目前临床上ndrv的诊断方法主要为血清学诊断和分子生物学诊断方法，其中elisa技术易出现假阳性，qpcr技术需专业荧光检测设备，不能满足资源有限地区的检测需求，缺乏兼具操作简单、灵敏度高、试剂耗材成本低、特异性好、仪器设备要求低等优点的检测方法，建立一种快速、灵敏、可靠的检测技术迫在眉睫。

技术实现思路

1、针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种基于raa-crispr-cas13a快速精准检测新型鸭正呼肠孤病毒的方法及应用，本发明建立的检测方法能够临栏检测(又称现场检测)，无需专业设备及人员，操作简便，结果快速可靠，通过观察荧光状态以及试纸条的结果即可做出诊断，为预防和控制ndrv的流行提供了有力的分子工具。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明第一方面，提供了一种新型鸭正呼肠孤病毒的检测组合物，所述检测组合物包括：特异性raa引物对、检测新型鸭正呼肠孤病毒的crrna、rna报告探针和cas13a；

4、所述raa引物对核苷酸序列如seq id no.1-seq id no.2所示；

5、所述检测新型鸭正呼肠孤病毒的crrna核苷酸序列如seq id no.3所示；

6、所述rna报告探针为用于荧光检测的rna报告探针或用于试纸条检测的rna报告探针。

7、所述用于荧光检测的rna探针为荧光基团和荧光淬灭基团双标记的rna探针，其序列为fam-rurururururu-bhq1；所述用于试纸条检测的rna报告探针为异硫氰基荧光素和生物素双标记的rna探针，其序列为fitc-rurururururu-bio。

8、本发明第二方面，提供了上述检测组合物在制备检测新型鸭正呼肠孤病毒可视化检测产品中的应用。

9、本发明第三方面，提供了一种新型鸭正呼肠孤病毒的raa-crispr-cas13a检测试剂盒，所述raa-crispr-cas13a检测试剂盒含有上述检测组合物。

10、所述raa-crispr-cas13a检测试剂盒还包括新型鸭正呼肠孤病毒阳性质粒标准品，所述新型鸭正呼肠孤病毒阳性质粒标准品由如下方法制备而成：

11、扩增新型鸭正呼肠孤病毒σc基因得到扩增产物，将扩增产物连接到pmd-19t载体上，筛选阳性克隆并提取质粒dna，制备得到新型鸭正呼肠孤病毒阳性质粒标准品。

12、本发明第四方面，提供了上述raa-crispr-cas13a检测试剂盒在进行新型鸭正呼肠孤病毒流行病学调查中的应用。

13、本发明第五方面，提供了一种基于raa-crispr-cas13a系统的新型鸭正呼肠孤病毒试剂盒检测方法，包括如下步骤：

14、(1)提取待测样品的rna，反转录为cdna；

15、(2)以步骤(1)获得的cdna为模板，使用raa-crispr-cas13a检测试剂盒对待测样品进行实时pcr扩增，观察扩增曲线。

16、本发明第六方面，提供了一种基于raa-crispr-cas13a系统的新型鸭正呼肠孤病毒试纸条检测方法，包括如下步骤：

17、(1)提取待测样品的rna，反转录为cdna；

18、(2)以(1)中获得的cdna为模板，基于raa-crispr-cas13a系统检测反应体系进行反应，将反应产物进行2-20倍稀释，将试纸条结合垫端插入反应稀释液中，待判读区浸润后，取出平放，并于10分钟内进行结果判读。

19、所述结果判读标准为：若试纸条t线位置出现红色条带或t线和c线位置均出现红色条带时，则表示待测样品为阳性；若试纸条t线位置不出现红色条带，在c线上出现红色条带，则表示待测样品为阴性；若试纸条t线位置和c线位置均未出现红色条带，表示所用的试纸条或扩增试剂已经损坏、失效或者检测过程中操作有误

20、本发明具有以下有益效果

21、1、本发明将ndrvσc基因作为检测靶标，设计raa引物对和crrna，建立了一种基于raa-crispr-cas13a系统的新型鸭正呼肠孤病毒检测方法，基于该检测系统对ndrv特异性检测强，能够避免出现假阳性问题，可在室温下40分钟内实现ndrv的快速检测，检测灵敏度达到100copies/μl。

22、2.本发明建立的基于raa-crispr-cas13a酶分子系统的ndrv核酸检测方法，无需在标准专业实验室操作昂贵试验设备，可通过便携式可视化横向流量试纸条实现临床样本的现场检测，操作简便，结果快速可靠，为ndrv的流行病学调查、诊断，特别是兽医基层和养殖场提供了新的实用技术，有利于ndrv的有效防控。

技术特征：

1.一种新型鸭正呼肠孤病毒的检测组合物，其特征在于，所述检测组合物包括：特异性raa引物对、检测新型鸭正呼肠孤病毒的crrna、rna报告探针和cas13a；

2.根据权利要求1所述的新型鸭正呼肠孤病毒的检测组合物，其特征在于，所述用于荧光检测的rna报告探针为fam-rurururururu-bhq1；所述用于试纸条检测的rna报告探针为fitc-rurururururu-bio。

3.权利要求1所述的检测组合物在制备检测新型鸭正呼肠孤病毒可视化检测产品中的应用。

4.一种新型鸭正呼肠孤病毒的raa-crispr-cas13a检测试剂盒，其特征在于，所述raa-crispr-cas13a检测试剂盒含有权利要求1所述的检测组合物。

5.根据权利要求4所述的raa-crispr-cas13a检测试剂盒，其特征在于，所述raa-crispr-cas13a检测试剂盒还包括新型鸭正呼肠孤病毒阳性质粒标准品，所述新型鸭正呼肠孤病毒阳性质粒标准品由如下方法制备而成：

6.权利要求4或5所述的raa-crispr-cas13a检测试剂盒在进行新型鸭正呼肠孤病毒流行病学调查中的应用。

7.一种基于raa-crispr-cas13a系统的新型鸭正呼肠孤病毒试剂盒检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

8.一种基于raa-crispr-cas13a系统的新型鸭正呼肠孤病毒试纸条检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

9.根据权利要求8所述的新型鸭正呼肠孤病毒试纸条检测方法，其特征在于，所述结果判读标准为：若试纸条t线位置出现红色条带或t线和c线位置均出现红色条带时，则表示待测样品为阳性；若试纸条t线位置不出现红色条带，在c线上出现红色条带，则表示待测样品为阴性；若试纸条t线位置和c线位置均未出现红色条带，表示所用的试纸条或扩增试剂已经损坏、失效或者检测过程中操作有误。

技术总结
本发明属于生化与分子生物学技术领域，具体公开了一种RAA‑CRISPR‑Cas13a检测新型鸭正呼肠孤病毒(NDRV)核酸方法及应用。本发明基于设计的RAA引物对和crRNA建立了一种基于RAA‑CRISPR‑Cas13a酶分子系统的NDRV核酸检测，该系统特异性强，灵敏度高，可在40分钟内实现NDRV的快速检测，检测灵敏度达到10<supgt;0</supgt;copies/μL。此外，该系统无需在标准专业实验室操作昂贵试验设备，可通过便携式可视化横向流量试纸条实现临床样本的现场检测。

技术研发人员：王鸿志,方仁东,姜晨晨,雷迪,徐博艺
受保护的技术使用者：西南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5