一种顶头孢霉生产菌株原生质体制备和再生的方法

本发明涉及微生物制药和工业生物，具体涉及一种顶头孢霉生产菌株原生质体高效制备和再生的方法及应用。

背景技术：

1、丝状真菌基因组庞大复杂，细胞壁成分复杂，针对丝状真菌的遗传操作比单细胞真菌和酵母的难度大。目前丝状真菌的遗传转化方法有原生质体转化法、农杆菌介导法、基因枪法、电转法和醋酸锂介导转化方法等，其中最为常用的是原生质体转化方法。

2、头孢菌素c是临床上广泛使用的头孢类抗生素的重要前体物，优点是具有较强的稳定性、广谱的抗性和较低的毒性等。目前头孢菌素c是由丝状真菌顶头孢霉(acremoniumchrysogenum)发酵产生的，高产头孢菌素c的顶头孢霉工业菌株基本是通过传统诱变方法获得。不同于模式真菌底盘构巢曲霉等研究较多的丝状真菌，顶头孢霉由于缺乏完善的遗传操作体系，应用基因编辑技术等现代基因工程和代谢工程的方法对顶头孢霉工业生产菌株进行遗传改造是亟待发展的技术领域。通过代谢工程等合成生物学技术将为提高顶头孢霉工业生产菌株的发酵水平，降低生产成本奠定基础。

3、顶头孢霉工业菌株的细胞壁成分非常复杂，将外源dna转化进入顶头孢霉细胞需要高效的遗传转化体系，而原生质体转化法是丝状真菌主要的转化方法之一。原生质体转化法是以丝状真菌原生质体的高效制备和细胞壁再生为基础的，因此在实际对头孢菌素c工业生产菌株进行菌种遗传改造之前，开发针对顶头孢霉工业菌株的原生质体转化方法和再生方法具有重要的意义。我们通过参考模式真菌构巢曲霉等的原生质体转化方法，对细胞壁水解酶酶种类和复配比、酶解时间、再生培养基配方和涂布方法等方面的探索考察了顶头孢霉原生质体的制备和再生条件，对顶头孢霉菌工业菌株原生质体的制备和再生条件进行了系统优化。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种高效的适用于高产头孢菌素c的顶头孢霉工业菌株原生质体制备和细胞壁再生的方法。

2、为了达到上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

3、本发明提供一种顶头孢霉工业生产菌株原生质体制备的方法，其特征在于，包括以下步骤：

4、s1将纤维素酶、溶壁酶和复合酶yatalase混合溶解于渗透压缓冲液中制备得到酶解液；

5、s2取顶头孢霉工业菌株菌体液体发酵；离心收集的菌体重悬于含dtt的渗透压缓冲液中孵育；

6、s3然后加入纤维素酶、溶壁酶和复合酶yatalase混合溶解于渗透压缓冲液制备得到的酶解液中进行酶解释放原生质体；

7、s4进一步处理得到原生质体。

8、优选地，所述酶解液是纤维素酶cellulase、溶壁酶lysing enzyme和复合酶yatalase按2-4：2-4：3-5质量比(优选为3：3：4质量比)溶解于渗透压缓冲液得到；

9、具体浓度为5-15mg/ml酶解液，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌备用。

10、进一步地，液体发酵是将新鲜顶头孢霉生产菌株菌体接种于csl液体发酵培养基，180-240rpm，25-30℃摇菌3-6d；再将csl培养基中的培养物按5-15％体积比接种yps液体培养基，180-240rpm，25-30℃振荡培养16-20h。

11、具体地，所述s2步具体操作是于5000-8000rpm离心2-10min收集菌丝，用渗透压缓冲液洗涤2-3遍，离心收集菌体，重悬于含5-15mm dtt的渗透压缓冲液中，50-150rpm，25-32℃振荡孵育0.5-1.5h。

12、另外具体地，所述s3步具体操作是对s2步孵育后的菌液离心收集菌体，用渗透压缓冲液洗涤2-3遍，加入酶解液，28-32℃，50-130rpm酶解2-3h,镜检至菌丝大量释放原生质体。

13、在具体实施方式中，所述s4步具体操作是加入3-8倍体积的渗透压缓冲液终止反应，4-6层灭菌擦镜纸过滤除去菌丝；滤过液1000-3000rpm离心2-8min收集原生质体，用渗透压缓冲液洗涤原生质体除去残留的酶解液，然后用渗透压缓冲液重悬原生质体。

14、本发明提供一种顶头孢霉工业生产菌株原生质体再生的方法，其包括如下步骤：

15、a1：用所述方法得到的原生质体细胞和含琼脂的渗透压缓冲液混合；

16、a2：混匀轻柔涂布均匀铺在再生培养基平板上，正置培养后倒置培养至再生转化子长出。

17、具体地，再生培养基配方为：麦芽汁100(v/v)，麦芽糖40g/l，聚蛋白胨20g/l，蔗糖20g/l；0.6m kcl，25mm cacl2，10mm mgcl2，琼脂粉20g/l，灭菌前ph 7.0；

18、优选地，a2步中于25-30℃培养箱中正置培养0.5-2d，倒置培养4-8d至再生转化子长出。

19、本发明还提供所述的方法在对顶头孢霉工业生产菌株进行遗传改造过程中应用。

20、本发明公开的一种顶头孢霉工业生产菌株原生质体高效制备和再生的方法可高效获得较多量且活性好的原生质体、再生效率高，为应用于顶头孢霉工业生产菌株进行基因编辑等遗传改造和基因工程领域的遗传转化体系建立和优化提供了新的选择。

技术特征：

1.一种顶头孢霉工业生产菌株原生质体制备的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶解液是纤维素酶cellulase、溶壁酶lysing enzyme和复合酶yatalase按2-4：2-4：3-5质量比(优选为3：3：4质量比)溶解于渗透压缓冲液得到；

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，液体发酵是将新鲜顶头孢霉生产菌株菌体接种于csl液体发酵培养基，180-240 rpm，25-30℃摇菌3-6 d；再将csl培养基中的培养物按5-15 %体积比接种yps液体培养基，180-240 rpm，25-30℃振荡培养16-20h。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述s2步具体操作是于5000-8000 rpm离心2-10 min收集菌丝，用渗透压缓冲液洗涤2-3遍，离心收集菌体，重悬于含5-15 mm dtt的渗透压缓冲液中，50-150 rpm，25-32℃振荡孵育0.5-1.5 h。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述s3步具体操作是对s2步孵育后的菌液离心收集菌体，用渗透压缓冲液洗涤2-3遍，加入酶解液，28-32℃，50-130 rpm酶解2-3 h, 镜检至菌丝大量释放原生质体。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述s4步具体操作是加入3-8倍体积的渗透压缓冲液终止反应，4-6层灭菌擦镜纸过滤除去菌丝；滤过液1000-3000 rpm离心2-8 min收集原生质体，用渗透压缓冲液洗涤原生质体除去残留的酶解液，然后用渗透压缓冲液重悬原生质体。

7.一种顶头孢霉工业生产菌株原生质体再生的方法，其特征在于，包括如下步骤：

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，再生培养基配方为：麦芽汁100（v/v），麦芽糖40 g/l，聚蛋白胨20 g/l，蔗糖20 g/l；0.6 m kcl，25 mm cacl2，10 mm mgcl2，琼脂粉20 g/l，灭菌前ph 7.0。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，a2步中于25-30℃培养箱中正置培养0.5-2d，倒置培养4-8 d至再生转化子长出。

10.如权利要求1至9任一项所述的方法在对顶头孢霉工业生产菌株进行遗传改造过程中应用。

技术总结
本发明公开了一种顶头孢霉工业生产菌株原生质体制备和再生的方法。本发明包括以下步骤：将纤维素酶、溶壁酶和复合酶Yatalase混合溶解于渗透压缓冲液中制备得到混合酶解液；取新鲜顶头孢霉工业菌株菌体液体发酵后，离心收集的菌体重悬于含DTT的渗透压缓冲液中孵育，然后加入混合酶解液中进行酶解，得到原生质体；将原生质体和含琼脂的渗透压缓冲液混合，均匀铺在再生培养基平板上，培养至再生转化子长出。本发明的原生质体制备和再生方法可高效获得较多量活性好的原生质体，在具体实例中原生质体再生率可达23.7%，可用于对顶头孢霉工业生产菌株进行基因编辑等遗传改造过程和基因工程领域。

技术研发人员：高书山,丁忠涛,杨路佳,崔成森,刘向红,孙雅琪
受保护的技术使用者：中国科学院天津工业生物技术研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5