一种用于检测线虫埃斯特菌的引物对及其应用的制作方法

本发明涉及微生物，尤其涉及一种用于检测线虫埃斯特菌的引物对及其应用。

背景技术：

1、松材线虫是全球重大检疫性有害生物，其具有强大的毁灭性，被称为松树的“癌症”。目前采用的药剂防治方法主要是喷洒化学药剂杀灭媒介昆虫，树干注射甲维盐等防治松材线虫，存在化学药剂污染环境、树干注射方法不宜大规模应用等问题。

2、线虫埃斯特菌 esteya vermicola是世界上第一个被报道的松材线虫内寄生真菌，对松材线虫表现出高侵染性和致死率。专利号为zl202011558429.4的中国专利授权了一种伊氏杀线虫真菌及其应用，该菌株为线虫埃斯特菌fxy120菌株，分离自我国的松树组织，在林间可通过树冠喷洒和树干注射孢子悬浮液防治松材线虫。在喷洒或注射该菌后，通过组织分离法可以从松树组织中再次分离到该菌，表明该菌可在松树体内定殖，但该方法耗时长，工作量大且不易获得目的菌株，这使得该菌的鉴定具有一定的偶然性和随机性。随着分子生物学的快速发展，基于序列测序的方法已经被广泛应用于目的菌株的鉴定，pcr检测能特异性扩增菌株的dna片段，免除了传统方法中对菌株的分离培养步骤，操作简单、快速准确。目前尚未有线虫埃斯特菌pcr检测的特异性引物，建立一种快速鉴定线虫埃斯特菌的方法，将有利于评估其在松树上的定殖能力，为进一步优化该菌在林间的使用提供技术支撑。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供了一种用于检测线虫埃斯特菌的引物对，该引物对能够独特地从线虫埃斯特菌dna中扩增出清晰的目的片段，从而判断待测样本中是否存在线虫埃斯特菌。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种用于检测线虫埃斯特菌的引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物；

4、所述正向引物的序列如seq id no:1所示；

5、所述反向引物的序列如seq id no:2所示。

6、本发明还提供了所述的引物对在制备检测线虫埃斯特菌的试剂盒中的应用。

7、本发明还提供了一种检测线虫埃斯特菌的试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物对。

8、本发明还提供了一种检测线虫埃斯特菌的方法，包括如下步骤：

9、以待测样本的dna为模板，采用所述的引物对进行pcr扩增，得到扩增产物；使用琼脂糖凝胶电泳法检测扩增产物的扩增情况，判断是否存在线虫埃斯特菌。

10、作为优选，所述待测样本为真菌菌体或松树组织；

11、所述松树组织为松树的针叶、侧枝或主干。

12、作为优选，所述pcr扩增的反应体系为：0.5~1.5μl模板，8~12μl 2×taq pcrmaster，0.3~0.7μl正向引物，0.3~0.7μl反向引物，6~10μl ddh2o。

13、作为优选，所述pcr扩增的反应条件为：92~96℃预变性4~6min；92~96℃变性20~40s，56~60℃退火20~40s，70~74℃延伸20~40s，共33~37个循环；70~74℃延伸4~6min。

14、作为优选，若检测出522bp的条带，则待测样本中含有线虫埃斯特菌；若未检测出522bp的条带，则待测样本中不含有线虫埃斯特菌。

15、本发明的有益效果：

16、本发明提供了一种用于检测线虫埃斯特菌的引物对，该引物对能够独特地从线虫埃斯特菌dna中扩增出清晰的目的片段，从而判断待测样本中是否存在线虫埃斯特菌；且该引物对具有特异性好、经济且耗时短等优点，可为线虫埃斯特菌的快速鉴定及该菌在松树体内的定殖检测提供技术指导。

技术特征：

1.一种用于检测线虫埃斯特菌的引物对，其特征在于，所述引物对包括正向引物和反向引物；

2.权利要求1所述的引物对在制备检测线虫埃斯特菌的试剂盒中的应用。

3.一种检测线虫埃斯特菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物对。

4.一种检测线虫埃斯特菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述待测样本为真菌菌体或松树组织；

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述pcr扩增的反应体系为：0.5~1.5μl模板，8~12μl 2×taq pcr master，0.3~0.7μl正向引物，0.3~0.7μl反向引物，6~10μl ddh2o。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述pcr扩增的反应条件为：92~96℃预变性4~6min；92~96℃变性20~40s，56~60℃退火20~40s，70~74℃延伸20~40s，共33~37个循环；70~74℃延伸4~6min。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，若检测出522bp的条带，则待测样本中含有线虫埃斯特菌；若未检测出522bp的条带，则待测样本中不含有线虫埃斯特菌。

技术总结
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种用于检测线虫埃斯特菌的引物对及其应用。本发明提供了一种用于检测线虫埃斯特菌的引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物；所述正向引物的序列如SEQ ID NO:1所示；所述反向引物的序列如SEQ ID NO:2所示。本发明的引物对能够独特地从线虫埃斯特菌DNA中扩增出清晰的目的片段，从而判断待测样本中是否存在线虫埃斯特菌；且该引物对具有特异性好、经济且耗时短等优点，可为线虫埃斯特菌的快速鉴定及该菌在松树体内的定殖检测提供技术指导。

技术研发人员：理永霞,温晓健,王璇,张伟,冯宇倩,刘振凯,李东振,张星耀
受保护的技术使用者：中国林业科学研究院森林生态环境与自然保护研究所（国家林业和草原局世界自然遗产保护研究中心）
技术研发日：
技术公布日：2024/11/14