用于鱼粉猪源性成分检测的引物组、试剂盒及其应用

本发明属于食品检测领域，涉及鱼粉中猪源成分的检测，特别是指用于鱼粉猪源性成分检测的引物组、试剂盒及其应用。

背景技术：

1、鱼粉是由一种或多种鱼经脱油、脱水、粉碎后制成的高蛋白粉状饲料成分，含有丰富的必需氨基酸、维生素（如维生素a、维生素d、烟酸等）和矿物质（如铁、锌、钙、磷等），是饲料工业中主要的动物源性饲料原料。尤其随着全球渔业的快速发展，水产养殖对鱼粉的需求越来越大，但近年来，有限的海洋资源使鱼粉的产量呈下降趋势。需求激增与供应逐渐减少之间的不平衡，导致鱼粉价格迅速上涨。巨大的利润驱使鱼粉中掺入廉价的蛋白质现象日趋严重，这对养殖动物健康乃至人类健康构成了威胁。另外，动物源性副产品比如头部、内脏、骨骼等碎片加工后，与鱼粉的物理性质比如形状、颜色、质地等高度相似，无法通过显微镜观察进行全面、客观地鉴别。因此，亟需一种快速、准确检测鱼粉质量的方法。

2、公开号cn116463429a的申请公开了一种pcr检测鱼粉中南美白对虾源性成分的方法，该方法是通过设计南美对虾的荧光定量引物进行检测；公开号cn117265130a公开了一种鱼粉中巴沙鱼源性成分定性和定量鉴定的方法，通过针对性的设计对巴沙鱼检测的引物进行荧光定量pcr。该类聚合酶链式反应（pcr）或荧光定量pcr可鉴定鱼粉中掺假成分，但此检测技术需要温度循环扩增，检测时间合计超过1.5 h，需要专门仪器设备及专业操作人员。因此一种对仪器要求不高，可准确、快速检测鉴定出鱼粉中猪源性成分等温扩增检测试剂盒，对鉴别鱼粉质量，保证饲料产品质量及品质具有重大意义。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提出一种用于鱼粉猪源性成分检测的引物组、试剂盒及其应用，实现对鱼粉质量的准确、快速筛查。

2、本发明的技术方案是这样实现的：

3、本发明提供的鉴别鱼粉中猪源性成分核酸检测引物组，根据ncbi公布的全长为16720 bp的猪线粒体基因序列（genbank: mh603005.1），应用primer explorer软件设计并筛选猪腺苷三磷酸合成酶基因特异性引物组。通过该特异性基因组等温扩增靶基因序列，开发为鱼粉质量检测试剂盒，该试剂盒可通过肉眼观测颜色变化判断结果，从分子水平上快速准确筛查鱼粉质量。

4、本申请请求保护一种用于鱼粉猪源性成分检测的引物组，包括外引物对f3-1和b3-1、内引物对fip-1和bip-1以及环引物对lf-1和lb-1；

5、所述f3-1的序列如seq id no.1所示、b3-1的序列如seqid no.2所示、fip-1的序列如seq id no.3所示、bip-1的序列如seqid no.4所示、lf-1的序列如seq id no.5所示、lb-1的序列如seqid no.6所示。

6、还请求保护一种鱼粉猪源性成分检测试剂盒，包括上述的引物组。

7、上述的鱼粉猪源性成分检测试剂盒，还包括实现环介导等温扩增反应所需要的试剂。

8、上述的鱼粉猪源性成分检测试剂盒，包括反应预混液a和反应预混液b；

9、所述反应预混液a包括引物组、10×反应缓冲液、dntps、硫酸镁、甜菜碱、hnb染料和depc水；反应预混液b为bst dna大片段聚合酶。

10、上述反应预混液a中引物组中外引物对的浓度为0.4μm、内引物对的浓度为1.6μm、环引物对的浓度为0.8μm。

11、上述反应预混液a中dntps 1.5-3.5 mm、甜菜碱 0.6-1.6 m、硫酸镁6-8mm以及hnb染料130μm。

12、优选的，反应预混液a中各组分浓度为dntps 1.5 mm、2.5 mm或3.5mm；甜菜碱0.6m、0.9 m、1.6 m；硫酸镁6 mm、7.5 mm、8 mm。

13、上述bst dna大片段聚合酶的终浓度为20-100 u。

14、上述的鱼粉猪源性成分检测试剂盒在可视化检测鱼粉质量中的应用。

15、上述的应用，步骤如下：

16、（1）提取待测鱼粉的基因组作为待检样品，浓度为1-10 ng/μl；

17、（2）按照21 μl反应预混液a，2 μl反应预混液b和待检样品2 μl的反应体系，进行环介导等温扩增反应；

18、（3）观察反应体系的颜色变化判定是否含有猪源性成分。

19、通过与比色卡对比，观察检测管内反应体系的颜色变化，判定：反应体系的颜色由紫罗兰色变为天蓝色，检测结果则判定为阳性，即检测样本中含有猪源性成分；反应体系的颜色呈紫罗兰色，检测结果则判定为阴性，即检测样本中不含有猪源性成分。

20、本发明具有以下有益效果：

21、1、本发明根据genebank中公布的猪线粒体中atp基因序列，设计特异性核酸检测引物组，用于特异性检测猪源性成分。实验表明，本发明试剂盒，可特异性检测猪源性成分，与鸡源性成分、鸭源性成分、牛源性成分、羊源性成分等不发生交叉反应；

22、2、本发明提供的鱼粉质量等温扩增核酸检测试剂盒，针对鱼粉样本，在60-70℃等温条件下，35-50 min内可准确、快速检测筛查鱼粉中猪源性成分；

23、3、本发明提供的鱼粉质量等温扩增核酸检测试剂盒不需要温度循环，对仪器要求不高，检测结果判定简单，可视化观测反应体系的颜色变化判定检测结果。本发明提供的鱼粉质量等温扩增核酸检测试剂盒，操作简单，不需要专业人员及精密仪器，可用于公司、检验中心对含有猪源性成分的鱼粉进行快速筛查。

技术特征：

1.用于鱼粉猪源性成分检测的引物组，其特征在于：包括外引物对f3-1和b3-1、内引物对fip-1和bip-1以及环引物对lf-1和lb-1；

2.一种鱼粉猪源性成分检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的引物组。

3.根据权利要求2所述的鱼粉猪源性成分检测试剂盒，其特征在于：还包括实现环介导等温扩增反应所需要的试剂。

4.根据权利要求3所述的鱼粉猪源性成分检测试剂盒，其特征在于：包括反应预混液a和反应预混液b；

5.根据权利要求4所述的鱼粉猪源性成分检测试剂盒，其特征在于：所述反应预混液a中引物组中外引物对的浓度为0.4μm、内引物对的浓度为1.6μm、环引物对的浓度为0.8μm。

6. 根据权利要求4所述的鱼粉猪源性成分检测试剂盒，其特征在于：所述反应预混液a其他各组分的终浓度为dntps 1.5-3.5 mm、甜菜碱 0.6-1.6 m、硫酸镁6-8mm以及hnb染料130μm。

7. 根据权利要求4所述的鱼粉猪源性成分检测试剂盒，其特征在于：所述bst dna大片段聚合酶的终浓度为20-100 u。

8.权利要求2-7任一项所述的鱼粉猪源性成分检测试剂盒在可视化检测鱼粉质量中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤如下：

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：反应体系的颜色由紫罗兰色变为天蓝色，检测结果则判定为阳性，即检测样本中含有猪源性成分；反应体系的颜色呈紫罗兰色，检测结果则判定为阴性，即检测样本中不含有猪源性成分。

技术总结
本发明属于食品检测领域，涉及鱼粉中猪源成分的检测，特别是指用于鱼粉猪源性成分检测的引物组、试剂盒及其应用。发明提供的鉴别鱼粉中猪源性成分核酸检测引物组，根据NCBI公布的全长为16720 bp的猪线粒体基因序列（GenBank:MH603005.1），应用Primer Explorer软件设计并筛选猪腺苷三磷酸合成酶基因特异性引物组。通过该特异性基因组等温扩增靶基因序列，开发为鱼粉质量检测试剂盒，该试剂盒可通过肉眼观测颜色变化判断结果，从分子水平上快速准确筛查鱼粉质量。

技术研发人员：李俊敏,施传信,马冰冰,卢壮壮,韩进诚,张春梅,朱庆妍,谢汶彤,周庆峰
受保护的技术使用者：商丘师范学院
技术研发日：
技术公布日：2024/12/2