一种监测细胞核感知胞外机械刺激动态响应的方法与装置

本发明涉及人体内细胞研究，尤其是一种监测细胞核感知胞外机械刺激动态响应的方法与装置。

背景技术：

1、人体内细胞处于一种高度拥挤的微环境，细胞与邻近细胞和细胞外微环境(ecm)之间存在复杂且难以测量的力作用。尤其在肿瘤形成过程中，细胞的生长和增殖调控失效，使得细胞—细胞和细胞—ecm之间的力学联系变得更加紧密。细胞具有感知外界机械信号并适应性地调整其生化行为的能力，而这种机械响应能力的失调和相关信号传递通路的紊乱往往会导致各种疾病(如癌症)的发生和发展。有研究发现：细胞依赖细胞核为标尺来调节动力，通过细胞核感知并产生用于改变细胞行为的信号来做出反应，确保细胞能够适应、存活并有效地通过拥挤和机械异质性的微环境，这一过程与癌细胞侵袭、免疫反应和胚胎发育有关。因此，探索单个活细胞如何感知外部机械约束并适应性调节自身行为的机制，成为研究细胞力学的重要课题之一。

2、为此，我们提出一种监测细胞核感知胞外机械刺激动态响应的方法与装置法解决上述问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种监测细胞核感知胞外机械刺激动态响应的方法与装置，以解决上述背景技术中提出的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、一种监测细胞核感知胞外机械刺激动态响应装置，主要包括单细胞压缩的力学控制系统、恒温液相力学操控实验平台和荧光显微成像系统三个部分，

4、所述恒温液相力学操控实验平台的一侧配置有37℃恒温控制器；

5、所述单细胞压缩的力学操控系统由单细胞力学操控的功能化探针和力学反馈控制回路组成，单细胞压缩的力学操控系统通过1#激光器经1#会聚透镜和1#反射棱镜发出的激光光束，打在功能化探针背面完成反射，反射光进入力学扰度传感器，然后进入力学反馈控制器，通过对初始设置值和实际测量值的对比反馈，反馈信号输入集控系统；

6、所述荧光显微成像系统通过2#激光器发射波长可调激光，经3#会聚透镜的聚焦和2#反射棱镜的反射，经过二向色滤光片分光后，进入荧光显微目镜进行荧光信号激发；所获得荧光信号依次通过激光滤光片、2#会聚透镜和荧光信号增强和处理器完成荧光信号的采集、增强和处理，所获得的信号输入集控系统。

7、在进一步的实施例中，所述恒温液相力学操控实验平台的底部由ⅰ型collagen涂层铺涂在硬度为3kpa的paa水凝胶基底组成。

8、在进一步的实施例中，所述功能化探针为扁平型无尖端硅微悬臂，其背面镀有金属。

9、在进一步的实施例中，所述paa水凝胶基底是通过丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺混合的比例获得，再孵育ⅰ型胶原蛋白进行修饰。

10、本发明的另一目的在于提供一种监测细胞核感知胞外机械刺激动态响应方法，其特征在于：包括如下步骤：

11、s1、前24h，对hela细胞进行肌动蛋白细胞骨架、细胞核和yap蛋白进行荧光标记；

12、s2、前1h，胰蛋白酶消化重悬的hela细胞，以约1*105的密度接种在35mm的ⅰ型collagen包被3kpa的paa水凝胶基底，置于细胞培养箱完成细胞的贴壁吸附；

13、s3、将已完成荧光标记和重新贴壁的细胞移至恒温液相力学操控实验平台，采用可精确控制扰度的扁平无尖端型微悬臂进行单细胞压缩。采用集成的荧光显微成像系统记录压缩前细胞的形态学和yap定位信息；

14、s4、然后，对功能化探针加载1nn的恒定力，采用0.5微米/秒的力加载速率对细胞进行压缩，每隔2秒记录一次荧光图像；

15、s5、当细胞压缩至细胞核初始高度的1/2(约为细胞的半高值)时，停止力加载，最后一次记录荧光图像，同时注意观察细胞核和细胞骨架的形态，防止过载导致细胞膜和核膜的破损，如发生膜破损情况，该细胞的测量结果不纳入统计队列。

16、在进一步的实施例中，所述集成荧光显微成像系统，需要先对肌动蛋白细胞骨架、细胞核和yap蛋白进行荧光标记，从细胞压缩开始，每隔2秒记录一次荧光图像。假设细胞半高10微米，力加载速率约0.5微米/秒，则会记录10次的荧光图像，根据图像信息，可以实时监测在细胞压缩过程中，细胞和细胞核的形貌、大小的变化情况以及yap核易位的动态变化过程。

17、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

18、本发明可以在纳牛顿(nn)的力学尺度压缩单个活细胞，实时监测细胞形态变化和yap(yes-associated protein)蛋白的核易位动态过程，通过表征yap核易位(yap蛋白在细胞核和细胞质中荧光强度的比值)的动态过程，可以揭示细胞感知细胞外机械刺激并响应力学刺激的机制。本发明采用的主要方法：首先，人工修饰了可用于实现纳牛精度的单细胞力学操控的功能化探针；并制备了包被ⅰ型collagen的3kpa的paa水凝胶基底，构建仿人体生理条件的恒温液相力学操控实验平台；在该实验平台下方，集成了荧光显微成像系统，用于实时监测单细胞力学操控下活细胞的动态响应行为。

技术特征：

1.一种监测细胞核感知胞外机械刺激动态响应装置，其特征在于：主要包括单细胞压缩的力学控制系统、恒温液相力学操控实验平台(6)和荧光显微成像系统三个部分，

2.根据权利要求1所述的监测细胞核感知胞外机械刺激动态响应装置，其特征在于：所述恒温液相力学操控实验平台(6)的底部由ⅰ型collagen涂层(8)铺涂在硬度为3kpa的paa水凝胶基底(9)组成。

3.根据权利要求1所述的监测细胞核感知胞外机械刺激动态响应装置，其特征在于：所述功能化探针(7)为扁平型无尖端硅微悬臂，其背面镀有金属。

4.根据权利要求2所述的监测细胞核感知胞外机械刺激动态响应装置，其特征在于：所述paa水凝胶基底(9)是通过丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺混合的比例获得，再孵育ⅰ型胶原蛋白进行修饰。

5.一种基于权利要求1-4任意一项所述的监测细胞核感知胞外机械刺激动态响应装置的响应方法，其特征在于：包括如下步骤：

6.根据权利要求5所述的监测细胞核感知胞外机械刺激动态响应方法，其特征在于：所述集成荧光显微成像系统，需要先对肌动蛋白细胞骨架、细胞核和yap蛋白进行荧光标记，从细胞压缩开始，每隔2秒记录一次荧光图像，根据图像信息，可以实时监测在细胞压缩过程中，细胞和细胞核的形貌、大小的变化情况以及yap核易位的动态变化过程。

技术总结
本发明公开了一种监测细胞核感知胞外机械刺激动态响应的方法与装置，主要包括：单细胞压缩的力学控制系统、恒温液相力学操控实验平台和荧光显微成像系统三个部分。本发明可以在纳牛顿(nN)的力学尺度压缩单个活细胞，实时监测细胞形态变化和YAP(Yes‑associated protein)蛋白的核易位动态过程，通过表征YAP核易位(YAP蛋白在细胞核和细胞质中荧光强度的比值)的动态过程，可以揭示细胞感知细胞外机械刺激并响应力学刺激的机制。本发明采用的主要方法：首先，人工修饰了可用于实现纳牛精度的单细胞力学操控的功能化探针；并制备了包被Ⅰ型Collagen的3KPa的PAA水凝胶基底，构建仿人体生理条件的恒温液相力学操控实验平台；在该实验平台下方，集成了荧光显微成像系统。

技术研发人员：杨洪钦,刘秉扬,徐仁凤,林秀
受保护的技术使用者：福建师范大学
技术研发日：
技术公布日：2025/1/23