一种非组织培养的玉米遗传转化方法

本发明涉及基因工程，尤其涉及一种非组织培养的玉米遗传转化方法。

背景技术：

1、玉米既是重要的饲料和粮食作物，也是极其重要的工业原料作物。目前全球玉米产量稳步增长，但随着经济的快速发展和人民生活水平的迅速提高，玉米消费总量则持续增加，供求矛盾加剧。通过常规育种进行玉米的遗传改良是现在玉米增产的主要途径之一，但有限的遗传资源和比较长的育种周期等因素往往限制了其应用的潜力。

2、玉米遗传转化方法中使用的多为基因枪法和农杆菌转换方法，其中基因枪法的基本原理是利用表面附着有外源dna的金属微粒在高压装置中加速后高速运动到受体细胞中，从而达到转化dna的目的。

3、但是现有的基因枪法操作较为繁琐，操作过程中金属微粒在高速运动下，会对胚胎造成损伤，从而影响玉米遗传转化的效率和遗传稳定性。

技术实现思路

1、1.要解决的技术问题

2、本发明的目的是为了解决现有技术中基因枪法操作较为繁琐，操作过程中金属微粒在高速运动下，会对胚胎造成损伤的问题，而提出的一种非组织培养的玉米遗传转化方法。

3、2.技术方案

4、为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

5、一种非组织培养的玉米遗传转化方法，包括以下步骤：

6、步骤1：材料和培养基选择：选取健康、成熟的玉米种子作为起始材料，并准备适合玉米生长的培养基，并调整至适宜的生长条件；

7、步骤2：‌消毒处理‌：将种子用蒸馏水冲洗干净，以去除表面的杂质，使用消毒溶液对种子进行浸泡消毒，时间为20min，然后用蒸馏水彻底冲洗，以去除残留的消毒液；

8、步骤3：种子发芽：将消毒后的种子置于含有适宜营养成分的培养基中，在26℃的黑暗条件下进行培养，以促进其发芽，当种子发芽长度达到1-3cm时，取出并进行下一步处理；

9、步骤4：农杆菌培养与转化：

10、‌农杆菌准备‌：进行根癌农杆菌的增殖培养，得到足够的菌液；在一定温度和振荡转速下，对农杆菌进行培养，并加入适量的yeb培养液和乙酰丁香酮；

11、‌转化操作‌：将发芽的玉米种子取出并风干，然后将准备好的农杆菌菌液注入种子中，再次风干后，将种子栽入营养土中，并用含有适宜营养液的土壤进行浇水，保持土壤湿度在75%左右，在25℃的温度下继续培育，一周后移栽至花盆中，进行室温培养；

12、步骤5：转化体筛选与鉴定：经过一段时间的生长，通过分子生物学手段对转化体进行筛选和鉴定，确认外源基因是否已成功导入玉米基因组中；对筛选出的阳性转化体进行进一步的遗传分析和表型观察，评估其遗传稳定性和遗传特性。

13、优选地，所述步骤1中玉米生长培养基为ms培养基，ms培养基具体组成包括：硝酸钾2.3g/l、硝酸铵1.4g/l、磷酸二氢钾0.12g/l、硫酸镁0.15g/l、蔗糖23g/l、琼脂4g/l、碘化钾0.53mg/l、硼酸5.3mg/l、硫酸钠0.14mg/l、硫酸铜0.016mg/l、氯化钴0.023mg/l、乙二胺四乙酸二钠 26.5mg/l、甘氨酸1.2mg/l和盐酸吡哆醇0.3mg/l。

14、优选地，所述步骤2中消毒溶液为质量浓度为2%的次氯酸钠。

15、优选地，所述步骤3中每1l培养基含有：0.35g kno3、0.68g ca(no3)2·4h2o、0.16gmgso4·7h2o、4.00g琼脂糖、其余为水。

16、优选地，所述步骤4中培养温度为24-27℃，振荡转速为180-220rpm。

17、优选地，所述步骤5中分子生物学手段包括pcr和southern印迹杂交。

18、3.有益效果

19、相比于现有技术，本发明的优点在于：

20、本发明中，通过非组织培养技术，可以有效简化玉米遗传转化的操作，同时操作过程中可以完全避免对胚胎造成损伤，从而有效提高了玉米遗传转化的效率和遗传稳定性。

技术特征：

1.一种非组织培养的玉米遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种非组织培养的玉米遗传转化方法，其特征在于，所述步骤1中玉米生长培养基为ms培养基，ms培养基具体组成包括：硝酸钾2.3g/l、硝酸铵1.4g/l、磷酸二氢钾0.12g/l、硫酸镁0.15g/l、蔗糖23g/l、琼脂4g/l、碘化钾0.53mg/l、硼酸5.3mg/l、硫酸钠0.14mg/l、硫酸铜0.016mg/l、氯化钴0.023mg/l、乙二胺四乙酸二钠 26.5mg/l、甘氨酸1.2mg/l和盐酸吡哆醇0.3mg/l。

3.根据权利要求1所述的一种非组织培养的玉米遗传转化方法，其特征在于，所述步骤2中消毒溶液为质量浓度为2%的次氯酸钠。

4.根据权利要求1所述的一种非组织培养的玉米遗传转化方法，其特征在于，所述步骤3中每1l培养基含有：0.35g kno3、0.68g ca(no3)2·4h2o、0.16g mgso4·7h2o、4.00g琼脂糖、其余为水。

5.根据权利要求1所述的一种非组织培养的玉米遗传转化方法，其特征在于，所述步骤4中培养温度为24-27℃，振荡转速为180-220rpm。

6.根据权利要求1所述的一种非组织培养的玉米遗传转化方法，其特征在于，所述步骤5中分子生物学手段包括pcr和southern印迹杂交。

技术总结
本发明属于基因工程技术领域，具体为一种非组织培养的玉米遗传转化方法，包括以下步骤：步骤1：材料和培养基选择；步骤2：‌消毒处理‌：将种子用蒸馏水冲洗干净，以去除表面的杂质，使用消毒溶液对种子进行浸泡消毒，时间为20min，然后用蒸馏水彻底冲洗，以去除残留的消毒液；步骤3：种子发芽：将消毒后的种子置于含有适宜营养成分的培养基中，在26℃的黑暗条件下进行培养，当种子发芽长度达到1‑3cm时，取出并进行下一步处理；步骤4：农杆菌培养与转化；步骤5：转化体筛选与鉴定。本发明通过非组织培养技术，可以有效简化玉米遗传转化的操作，同时操作过程中可以完全避免对胚胎造成损伤，从而有效提高了玉米遗传转化的效率和遗传稳定性。

技术研发人员：薛晓东,李勤霞,吴珍
受保护的技术使用者：商洛学院
技术研发日：
技术公布日：2024/12/5