一种实时监测嵌合抗原受体T细胞活性的方法与流程

本申请属于生物医学和细胞治疗，尤其涉及一种实时监测嵌合抗原受体t细胞活性的方法。

背景技术：

1、car-t细胞疗法作为一种革新的细胞免疫治疗手段，已经在血液肿瘤的临床治疗中取得了显著效果。car-t作为一种具有良好前景的生物技术，是攻克肿瘤的重要手段。然而，对于car-t的研究仍然十分局限，以致于car-t技术在实体瘤治疗中仍为取得有效进展。

2、为了能进一步研究car-t细胞与肿瘤细胞之间的相互作用，以及car-t细胞的激活方式及激活情况，需要开发一种简单，有效的可监测的方式来表征car-t细胞。目前监测car-t细胞的手段主要有活细胞动态成像技术。活细胞动态成像技术对设备的依赖性较强，且价格昂贵，不适合普遍推广本发明利用基因工程的手段。

3、因此，亟需提供一种简单，高效的方式，既降低了设备的要求，也减少了对复杂的实验操作，以来实现对car-t细胞的活化状态的实时监测。

技术实现思路

1、本申请的目的在于提供一种实时监测嵌合抗原受体t细胞活性的方法，旨在解决现有技术中监测car-t细胞的费用昂贵、设备要求高且实验操作复杂的问题。

2、为实现上述申请目的，本申请采用的技术方案如下：

3、第一方面，本申请提供一种实时监测嵌合抗原受体t细胞活性的方法，包括如下步骤：将car序列、egfp序列、il2启动子序列和荧光蛋白序列克隆至载体中，得到重组质粒；

4、采用慢病毒将所述重组质粒进行包装得到含重组质粒的慢病毒沉淀；

5、提供t细胞混悬液，将所述含重组质粒的慢病毒沉淀与所述t细胞混悬液混合孵育，得到car-t细胞；

6、将所述car-t细胞与肿瘤细胞进行共培养，再使用流式细胞仪实时监测嵌合抗原受体t细胞活性。

7、在一些实施例中，所述荧光蛋白序列选自mcherry荧光蛋白。

8、在一些实施例中，采用慢病毒将所述重组质粒进行包装得到含重组质粒的慢病毒沉淀的步骤中，包括：提供辅助质粒，将辅助质粒与所述重组质粒混合得到混合质粒；

9、提供待用293t细胞，将所述混合质粒逐滴加入所述待用293t细胞中进行转染处理得到上清液；

10、将所述上清液采用慢病毒浓缩液进行浓缩处理，离心得到含重组质粒的慢病毒沉淀。

11、在一些实施例中，所述辅助质粒选自pspax质粒和pmd2g质粒，且，所述重组质粒与所述pspax质粒、pmd2g质粒的质量比为4:3:2。

12、在一些实施例中，将辅助质粒与所述重组质粒混合得到混合质粒的步骤中，还包括：提供pei转染剂，且所述pei转染剂的质量与所述辅助质粒和所述重组质粒的总质量的比值为3:1；将所述pei转染剂与所述辅助质粒与所述重组质粒混合均匀，静置处理15～20分钟，得到混合质粒。

13、在一些实施例中，所述待用293t细胞选自融合度为80％～90％的293t细胞。

14、在一些实施例中，将所述混合质粒逐滴加入所述待用293t细胞中进行转染处理得到上清液的步骤中，包括：将所述混合质粒逐滴加入所述待用293t细胞中混合处理8～9小时后进行换液处理，再进行转染处理48小时，得到上清液。

15、在一些实施例中，将所述上清液采用慢病毒浓缩液进行浓缩处理，离心得到含重组质粒的慢病毒沉淀的步骤中，包括：将所述上清液采用4倍数慢病毒浓缩液于4℃下进行过夜浓缩处理，再于4℃、2000g/min的条件下离心处理30分钟，得到含重组质粒的慢病毒沉淀。

16、在一些实施例中，所述t细胞混悬液的浓度为1×106细胞/ml，且所述t细胞混悬液与所述含重组质粒的慢病毒沉淀的体积比为2ml：100μl。

17、在一些实施例中，将所述含重组质粒的慢病毒沉淀与所述t细胞混悬液混合孵育的步骤中，包括：将所述含重组质粒的慢病毒沉淀与所述t细胞混悬液混合孵育的时间为24～25小时。

18、在一些实施例中，所述肿瘤细胞选自hct116肿瘤细胞。

19、在一些实施例中，将所述car-t细胞与肿瘤细胞进行共培养，使用流式细胞仪实时监测嵌合抗原受体t细胞活性的步骤中，包括：分别在共培养16小时及48小时收获共培养细胞，细胞使用cd3抗体进行避光孵育30分钟，收获细胞，使用流式细胞仪实时监测。

20、第一方面，本申请提供的一种实时监测嵌合抗原受体t细胞活性的方法，该方法利用一个在car-t激活过程中产生的细胞因子il2的启动子，利用下游荧光基因的表达来指征t细胞的激活，利用荧光的观察可以及时观察t细胞的激活情况；该方法利用car与egfp共表达系统，使用egfp来指示car的表达，而荧光基因用来显示t细胞的活化状态，使用双荧光系统，可以准确、实时描述car-t细胞的活化状态。

技术特征：

1.一种实时监测嵌合抗原受体t细胞活性的方法，其特征在于，包括如下步骤：将car序列、egfp序列、il2启动子序列和荧光蛋白序列克隆至载体中，得到重组质粒；

2.根据权利要求1所述的实时监测嵌合抗原受体t细胞活性的方法，其特征在于，所述荧光蛋白序列选自mcherry荧光蛋白。

3.根据权利要求1所述的实时监测嵌合抗原受体t细胞活性的方法，其特征在于，采用慢病毒将所述重组质粒进行包装得到含重组质粒的慢病毒沉淀的步骤中，包括：提供辅助质粒，将辅助质粒与所述重组质粒混合得到混合质粒；

4.根据权利要求3所述的实时监测嵌合抗原受体t细胞活性的方法，其特征在于，所述辅助质粒选自pspax质粒和pmd2g质粒，且，所述重组质粒与所述pspax质粒、pmd2g质粒的质量比为4:3:2；

5.根据权利要求3所述的实时监测嵌合抗原受体t细胞活性的方法，其特征在于，所述待用293t细胞选自融合度为80％～90％的293t细胞；和/或，

6.根据权利要求3所述的实时监测嵌合抗原受体t细胞活性的方法，其特征在于，将所述上清液采用慢病毒浓缩液进行浓缩处理，离心得到含重组质粒的慢病毒沉淀的步骤中，包括：将所述上清液采用4倍数慢病毒浓缩液于4℃下进行过夜浓缩处理，再于4℃、2000g/min的条件下离心处理30分钟，得到含重组质粒的慢病毒沉淀。

7.根据权利要求1所述的实时监测嵌合抗原受体t细胞活性的方法，其特征在于，所述t细胞混悬液的浓度为1×106细胞/ml，且所述t细胞混悬液与所述含重组质粒的慢病毒沉淀的体积比为2ml：100μl。

8.根据权利要求1所述的实时监测嵌合抗原受体t细胞活性的方法，其特征在于，将所述含重组质粒的慢病毒沉淀与所述t细胞混悬液混合孵育的步骤中，包括：将所述含重组质粒的慢病毒沉淀与所述t细胞混悬液混合孵育的时间为24～25小时。

9.根据权利要求1所述的实时监测嵌合抗原受体t细胞活性的方法，其特征在于，所述肿瘤细胞选自hct116肿瘤细胞。

10.根据权利要求1所述的实时监测嵌合抗原受体t细胞活性的方法，其特征在于，将所述car-t细胞与肿瘤细胞进行共培养，使用流式细胞仪实时监测嵌合抗原受体t细胞活性的步骤中，包括：分别在共培养16小时及48小时收获共培养细胞，细胞使用cd3抗体进行避光孵育30分钟，收获细胞，使用流式细胞仪实时监测。

技术总结
本申请涉及生物医学和细胞治疗技术领域，尤其涉及一种实时监测嵌合抗原受体T细胞活性的方法，该方法利用一个在CAR‑T激活过程中产生的细胞因子IL2的启动子，利用下游荧光基因的表达来指征T细胞的激活，利用荧光的观察可以及时观察T细胞的激活情况；该方法利用CAR与EGFP共表达系统，使用EGFP来指示CAR的表达，而荧光基因用来显示T细胞的活化状态，使用双荧光系统，可以准确、实时描述CAR‑T细胞的活化状态。

技术研发人员：陈渠,徐洋
受保护的技术使用者：深圳霁因生物医药转化研究院
技术研发日：
技术公布日：2025/1/23