一种基于CRISPR/Cas13a和引物交换反应一步检测miRNA的荧光生物传感器

本发明涉及生物医学检测领域，具体涉及一种基于crispr/cas13a和引物交换反应一步检测mirna的荧光生物传感器。

背景技术：

1、近年来，核酸生物标志物在临床疾病诊断和治疗等各个领域发挥着越来越重要的作用，包括循环肿瘤dna，基因突变dna以及各种调控基因表达的mrna，microrna（mirna）等。其中，mirna作为众多核酸标志物中的一员，其种类繁多，且具有高度的同源性，广泛的参与机体各类生命活动，也常常在各种环境中能见到它们的身影，例如血液，尿液等等。因其独特的生理功能和本身易降解，表达水平低（相比于其它核酸标志物）的特点，要实现复杂环境中灵敏和特异的检测无疑是非常困难的。目前，传统的检测手段依然局限于实时pcr，微阵列技术和核酸印迹技术。然而，这些技术各有自己的缺点，例如检测成本高（试剂和仪器昂贵），检测时间长，操作繁琐和易受干扰。这些缺陷导致了它们不能很好的适应当下临床快速检测的要求和条件。基于此，研究人员也尝试开发了诸如电化学生物传感器，化学发光以及拉曼光谱等技术手段来检测mirna。这些技术在一定程度上实现了标志物的灵敏和特异性检测，相较于上述几种传统检测技术有了提高。但是这些新技术仍然存在一个很大的问题是无法解决实验操作上的简单快速，即无法一步完成生物标志物的检测，分步的操作给检测结果带来了较大的不稳定，最终导致检测结果的不可靠性。因此，我们迫切需要开发一种全新的检测技术，能够实现简单快速且具有较好分析性能（高灵敏度，特异性和恒温）的检测我们的核酸生物标志物。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供。

2、为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、一种基于crispr/cas13a和引物交换反应一步检测mirna的荧光生物传感器，所述荧光生物传感器包括crispr/cas13a反应体系和dna聚合酶驱动的引物交换反应体系；

4、所述crispr/cas13a反应体系包含cas13a蛋白及其对应的crrna、发夹h1；所述crrna可与待测靶标mirna互补形成杂交双链并激活cas13a蛋白的rna酶活性，切割发夹h1，释放单链dna引物p1；

5、所述dna聚合酶驱动的引物交换反应体系包括bst3.0 dna聚合酶及其缓冲液、发夹h2、dntp和分子信标mb；发夹h2 3’端修饰倒置的t碱基以防止非特异性延伸，发夹h2茎秆末端g-c碱基对进行羟甲基化修饰以阻止聚合酶的延伸；p1可以与发夹h2的3’端互补结合，在bst3.0 dna聚合酶的帮助下，引物p1以发夹h2为模板，向前复制延伸，直到在羟甲基化修饰的位点终止，从而生成引物延伸序列p2，发夹h2上的互补序列通过竞争将p2从h2上置换下去，p2与分子信标mb互补杂交，将mb从发夹结构变成双链dna结构产生荧光信号；

6、发夹h1的核苷酸序列为：tct aca cgu uuu ucg tgt aga；

7、引物p1的核苷酸序列为：gt gta ga；

8、发夹h2的核苷酸序列为：gag gac agt ggc gct cmgmg gcc ttt tgg cmcmc gagcgc cac tgt cct ctc tac ac dt；

9、引物延伸序列p2的核苷酸序列为：gtgtagagaggacagtggcgctc；

10、分子信标mb的核苷酸序列为：fam-gtg tag aga gga gcg cca ctg tcc tct ctacac-bhq1。

11、在本发明的一些实施例中，当待测靶标mirna为mirna-21时，mirna-21的核苷酸序列为uag cuu auc aga cug aug uug a，其对应的crrna的核苷酸序列为gau uua gac uacccc aaa aac gaa ggg gac uaa aac uca aca uca guc uga uaa gcu au。

12、在本发明的一些实施例中，检测方法包括如下步骤：首先将含有待测靶标的样品与crispr/cas13a体系和dna聚合酶驱动的引物交换反应体系混合后孵育，反应结束后灭活dna聚合酶活性，检测荧光值。

13、在本发明的一些实施例中，所述荧光生物传感器的反应体系中各组分的浓度为：cas13a 5 nm、crrna 25 nm、发夹h1 200 nm、发夹h2 100 nm、dntp 10 mm、bst3.0 dna聚合酶16 u/20μl，分子信标mb 100 nm。

14、在本发明的一些实施例中，所述孵育的反应条件为37℃孵育2 h，所述灭活dna聚合酶活性的反应条件为80℃灭活5 min。

15、在本发明的一些实施例中，检测荧光值时参数设置为：激发波长480nm，发射波长范围为500-600nm，激发峰和发射峰的狭缝均为5nm。

16、本发明的有益效果在于：本发明的优势在于相比于传统的检测技术和新构建的其它技术，能够显著减少操作的复杂性，不需要多次闭盖开盖操作（增加气溶胶污染的可能性），全程在一个试管里完成，在两小时内就能得到荧光结果，从而快速分析待测物的存在并定量检测其含量。本发明顺利的将crispr/cas13a体系和dna聚合酶驱动的引物交换反应体系结合起来，一步实现了靶核酸的检测，显著降低了检测过程的不稳定性和操作的复杂性，展现出较大的临床应用潜力和价值。

技术特征：

1.一种基于crispr/cas13a和引物交换反应一步检测mirna的荧光生物传感器，其特征在于，所述荧光生物传感器包括crispr/cas13a反应体系和dna聚合酶驱动的引物交换反应体系；

2.根据权利要求1所述的荧光生物传感器，其特征在于，当待测靶标mirna为mirna-21时，mirna-21的核苷酸序列为uag cuu auc aga cug aug uug a，其对应的crrna的核苷酸序列为gau uua gac uac ccc aaa aac gaa ggg gac uaa aac uca aca uca guc uga uaagcu au。

3.根据权利要求1所述的荧光生物传感器，其特征在于，检测方法包括如下步骤：首先将含有待测靶标的样品与crispr/cas13a体系和dna聚合酶驱动的引物交换反应体系混合后孵育，反应结束后灭活dna聚合酶活性，检测荧光值。

4.根据权利要求3所述的荧光生物传感器，其特征在于，所述荧光生物传感器的反应体系中各组分的浓度为：cas13a 5 nm、crrna 25 nm、发夹h1 200 nm、发夹h2 100 nm、dntp10 mm、bst3.0 dna聚合酶16 u/20μl，分子信标mb 100 nm。

5.根据权利要求3所述的荧光生物传感器，其特征在于，所述孵育的反应条件为37℃孵育2 h，所述灭活dna聚合酶活性的反应条件为80℃灭活5 min。

6.根据权利要求3所述的电化学传感器，其特征在于，检测荧光值时参数设置为：激发波长480nm，发射波长范围为500-600nm，激发峰和发射峰的狭缝均为5nm。

技术总结
本发明公开了一种基于CRISPR/Cas13a和引物交换反应一步检测miRNA的荧光生物传感器，包括由Cas13a蛋白及其对应的crRNA和发夹H1构成的CRISPR/Cas13a反应体系和由Bst3.0 DNA聚合酶及其缓冲液、发夹H2、dNTP和分子信标MB构成的引物交换反应体系，实现了一步靶核酸的检测，显著降低了检测过程的不稳定性和操作的复杂性，展现出较大的临床应用潜力和价值。

技术研发人员：谢作维,唱凯,邓瑞佳,陈鸣,汤晓琦,赵爽,牛犇,谢霜,杨泓钊
受保护的技术使用者：中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院
技术研发日：
技术公布日：2025/1/13