一种重组融合木聚糖酶及用其制备不同分子量和结构特征的阿拉伯木聚糖的方法与流程

本发明涉及生物工程，尤其涉及一种重组融合木聚糖酶及用其制备不同分子量和结构特征的阿拉伯木聚糖的方法。

背景技术：

1、玉米是我国三大主粮之一，玉米皮是玉米深加工的副产品，占玉米总质量的10%～15%，其半纤维素含量达到70%左右。玉米皮纤维的木聚糖主链支链化程度非常高，超过70％的主链木糖残基具有一个或多个支链取代基团。

2、玉米皮纤维可降解为阿拉伯木聚糖（arabinoxylan，ax），阿拉伯木聚糖是一种天然多糖，根据其理化性质和生物学活性的不同，广泛应用于食品增稠、稳定、乳化等方面，例如可用于冷食品、饮料、乳制品、调味品、糕点、糖果、酿酒、食品保鲜与冷藏等食品行业。作为‌膳食纤维，阿拉伯木聚糖是健康饮食的重要组成部分，能够促进肠道蠕动，有助于消化，而阿拉伯木聚糖的生物学活性与其分子量和分子结构决定着其理化性质和生物学功能，进而影响ax的应用价值和应用领域。

3、阿拉伯木聚糖的制备方法主要包括化学法、物理法及酶法。酶法具有条件温和、酶解特异性强、产物可控、能最大限度地回收有效成分等优点。目前研究主要集中于对单酶分子的改造和优化，很少有研究关注酶分子量的大小与底物支链空间位阻对酶水解产物的影响。

技术实现思路

1、本发明从水解酶的选择和改造、酶的底物的改造两个方向进行设计，获得了特定分子量和结构特征的阿拉伯木聚糖，明确了木聚糖酶分子量大小、底物阿拉伯木聚糖的支链化程度对酶催化水解产物的对应关系。

2、基于此，提出了如下技术方案。

3、首先，本发明提供了一种重组融合木聚糖酶，其包括单结构域木聚糖酶和不具有底物催化/结合功能的蛋白结构域，其中，不具有底物催化/结合功能的蛋白结构域包括但不限于脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶、植酸酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶等其他酶类。

4、在具体实施过程中，不具有底物催化/结合功能的蛋白结构域包括在单结构域木聚糖酶的n端或c端进行融合表达。

5、优选地，所述不具有底物催化/结合功能的蛋白为脂肪酶。

6、优选地，所述重组融合木聚糖酶包括依次连接的单结构域木聚糖酶、linker与脂肪酶。

7、优选地，所述单结构域木聚糖酶为scxyn22、paxyn28或scxyn39。

8、优选地，所述scxyn22的氨基酸序列如seq id no.1所示；所述paxyn28的氨基酸序列如seq id no.2所示；所述scxyn39的氨基酸序列如seq id no.3所示；所述linker的氨基酸序列如seq id no.4所示；所述不具有底物催化/结合功能的蛋白的氨基酸序列如seq idno.5所示。

9、进一步，本发明提供了一种制备不同分子量和结构特征的阿拉伯木聚糖的方法，包括：用单结构域木聚糖酶scxyn22、paxyn28、scxyn39或所述的重组融合木聚糖酶水解玉米纤维胶，制得不同分子量和结构特征的阿拉伯木聚糖。

10、优选地，对于同一种单结构域木聚糖酶，水解玉米纤维胶中采用的重组融合木聚糖酶的分子量越大，获得的阿拉伯木聚糖的重均分子量越小，分子量分布越窄。

11、优选地，还包括：先使用阿拉伯呋喃糖苷酶scabf32酶解玉米纤维胶，然后使阿拉伯呋喃糖苷酶scabf32失活后，制得酶解产物；再用所述单结构域木聚糖酶或重组融合木聚糖酶水解酶解产物。

12、通过协同作用，先利用能够水解玉米纤维胶的阿拉伯糖支链的阿拉伯呋喃糖苷酶scabf32水解玉米纤维胶底物，降低底物支链比率和密度，提高木聚糖酶作用空间，再用不同分子量的木聚糖酶催化水解改造后的酶解产物，能够制备获得特定分子量和结构特征的阿拉伯木聚糖。

13、优选地，获得的阿拉伯木聚糖的重均分子量在90kda以下；数均分子量在50kda以下；峰值分子量在80g/mol以下。

14、优选地，scxyn22的反应ph为3.8~4.2；paxyn28的反应ph为3.8~4.2；scxyn39的反应ph为5.8~6.2；含有scxyn22的重组融合木聚糖酶的反应ph为3.8~4.2；含有scxyn39的重组融合木聚糖酶的反应ph为5.8~6.2；scabf32的反应ph为5.0~6.0。

15、优选地，scxyn22的反应温度为48~52℃；paxyn28的反应温度为58~62℃；scxyn39的反应温度为68~72℃；含有scxyn22的重组融合木聚糖酶的反应温度为58~62℃；含有scxyn39的重组融合木聚糖酶的反应温度为48~52℃；scabf32的反应温度为58~62℃。

16、优选地，所述玉米纤维胶的制备方法包括：

17、（1）称取玉米皮粉，加入正己烷、搅拌、过滤、清洗，干燥后以α-淀粉酶处理，然后加入糖化酶，向上述处理液中加入中性蛋白酶，酶解后灭活、过滤。

18、（2）称取步骤（1）获得的样品，加入naoh、ca(oh)2和水，加热，反应后离心分离上清和沉淀；

19、（3）向步骤（2）获得的上清液加入h2o2，调整溶液的ph为碱性，室温搅拌，然后将ph值调整到酸性，离心分离上清液，向上清液加入无水乙醇，得到白色絮状沉淀物cfg1。

20、（4）向步骤（2）获得的沉淀加入蒸馏水，再加入h2o2，调ph至碱性，加热，冷却后离心分离上清液，调节上清液的ph至为酸性，再离心分离上清液后加入无水乙醇，得到白色絮状沉淀cfg2。

21、（5）混合上述步骤（3）和步骤（4）获得的白色絮状沉淀物cfg1和白色絮状沉淀cfg2，冷冻干燥获得所述玉米纤维胶。

22、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

23、本发明从水解酶的选择和改造、酶的底物的改造两个方向进行设计，获得了特定分子量和结构特征的阿拉伯木聚糖，明确了木聚糖酶分子量大小、底物阿拉伯木聚糖的支链化程度对酶催化水解产物的对应关系。本发明为以玉米皮为原料工业化制备特定分子量的功能性阿拉伯木聚糖提供了基础，有助于粮食加工副产物的资源化利用，延长粮食加工产业链，带动粮食经济发展，具有广阔的应用前景。

技术特征：

1.一种重组融合木聚糖酶，其特征在于，其包括单结构域木聚糖酶和不具有底物催化/结合功能的蛋白结构域。

2.根据权利要求1所述的重组融合木聚糖酶，其特征在于，所述不具有底物催化/结合功能的蛋白为脂肪酶。

3.根据权利要求2所述的重组融合木聚糖酶，其特征在于，所述重组融合木聚糖酶包括依次连接的单结构域木聚糖酶、linker与脂肪酶。

4.根据权利要求1所述的重组融合木聚糖酶，其特征在于，所述单结构域木聚糖酶为scxyn22、paxyn28或scxyn39。

5.根据权利要求1~4中任一项所述的重组融合木聚糖酶，其特征在于，所述scxyn22的氨基酸序列如seq id no.1所示；所述paxyn28的氨基酸序列如seq id no.2所示；所述scxyn39的氨基酸序列如seq id no.3所示；所述linker的氨基酸序列如seq id no.4所示；所述不具有底物催化/结合功能的蛋白的氨基酸序列如seq id no.5所示。

6.一种制备不同分子量和结构特征的阿拉伯木聚糖的方法，其特征在于，包括：用单结构域木聚糖酶scxyn22、paxyn28、scxyn39或权利要求1~5中任一项所述的重组融合木聚糖酶水解玉米纤维胶，制得不同分子量和结构特征的阿拉伯木聚糖。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，对于同一种单结构域木聚糖酶，水解玉米纤维胶中采用的重组融合木聚糖酶的分子量越大，获得的阿拉伯木聚糖的重均分子量越小，分子量分布越窄。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，还包括：先使用阿拉伯呋喃糖苷酶scabf32酶解玉米纤维胶，然后使阿拉伯呋喃糖苷酶scabf32失活后，制得酶解产物；再用所述单结构域木聚糖酶或重组融合木聚糖酶水解酶解产物。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，获得的阿拉伯木聚糖的重均分子量在90kda以下；数均分子量在50kda以下；峰值分子量在80g/mol以下。

10.根据权利要求6~9中任一项所述的方法，其特征在于，scxyn22的反应ph为3.8~4.2；paxyn28的反应ph为3.8~4.2；scxyn39的反应ph为5.8~6.2；含有scxyn22的重组融合木聚糖酶的反应ph为3.8~4.2；含有scxyn39的重组融合木聚糖酶的反应ph为5.8~6.2；scabf32的反应ph为5.0~6.0；

技术总结
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种重组融合木聚糖酶及用其制备不同分子量和结构特征的阿拉伯木聚糖的方法。本发明从水解酶的选择和改造、酶的底物的改造两个方向进行设计，获得了特定分子量和结构特征的阿拉伯木聚糖，明确了木聚糖酶分子量大小、底物阿拉伯木聚糖的支链化程度对酶催化水解产物的对应关系。本发明为以玉米皮为原料工业化制备特定分子量的功能性阿拉伯木聚糖提供了基础，有助于粮食加工副产物的资源化利用，延长粮食加工产业链，带动粮食经济发展，具有广阔的应用前景。

技术研发人员：刘玉春,郭伟群,王超,郭超
受保护的技术使用者：国家粮食和物资储备局科学研究院
技术研发日：
技术公布日：2025/3/31