一种牛TXNIP基因双靶点敲除载体、构建方法及其应用

本发明属于生物，具体涉及一种牛txnip基因双靶点敲除载体、构建方法及其应用。

背景技术：

1、硫氧还蛋白互作蛋白(英文简称txnip)属于硫氧还蛋白结合蛋白的一种，通过抑制硫氧还蛋白系统的功能而发挥介导氧化应激、抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡等多种生理活动中发挥着重要作用。txnip是胰岛素中炎症过程的核心分子，这种炎症会导致人体胰脏中胰岛素生产细胞的死亡，txnip通过调节nlrp3参与2型糖尿病的发生。研究表明，txnip在多种癌细胞中的表达均降低，与黑色素瘤、肝细胞癌、乳腺癌、白血病等密切相关，是肿瘤抑制相关基因。txnip参与机体葡萄糖代谢、脂质代谢、免疫和炎症反应，从而调节细胞死亡、生长和分化。

2、相关技术中，张欢欢等利用talen技术制备了txnip基因敲除小鼠模型，具体而言，其在txnip第一外显子上设计了talen识别剪切位点，构建talen载体并在细胞水平验证其剪切活性，体外转录talens成mrna并通过纤维注射技术注射到c57bl/6j小鼠受精卵，对f0代小鼠进行dna水平鉴定获得txnip敲除小鼠。

3、然而，采用上述方法构建敲除模型，不可避免地需进行合成并组装具有特异性dna识别能力蛋白模块的繁琐操作，talen技术的dna识别模块的构建过程工作量大，实验成本高；敲除效率不高；细胞毒性较高。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种牛txnip基因双靶点敲除载体、构建方法及其应用。

2、为实现上述目的，本发明的技术方案为：

3、第一个方面，本发明提供一种牛txnip基因双靶点敲除载体，包括慢病毒表达载体、连接在所述慢病毒表达载体上的靶向牛txnip编码区的第一sgrna序列以及连接在所述慢病毒表达载体上的靶向txnip编码区的第二sgrna序列，所述第一sgrna序列对应的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示，所述第二sgrna序列对应的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如seq id no.3和seq id no.4所示。

4、可选地，所述第一sgrna序列靶向牛txnip编码区的sgrna56位点。

5、可选地，所述第二sgrna序列靶向牛txnip编码区的sgrna231位点。

6、可选地，所述慢病毒表达载体选自慢病毒表达载体plv。

7、可选地，所述慢病毒表达载体plv选自慢病毒表达载体plv3-u6-mcs-sgrna-cas9-egfp-puro(plv3)。

8、第二个方面，本发明提供如上所述牛txnip基因双靶点敲除载体的构建方法，包括以下步骤：

9、s1.将如seq id no.1和seq id no.2所示核苷酸序列进行退火，得到第一退火产物；

10、s2.将如seq id no.3和seq id no.4所示核苷酸序列进行退火，得到第二退火产物；

11、s3.将所述第一退火产物连入经限制性内切酶esp3i酶切后呈线性化的慢病毒表达载体，得到第一单靶点敲除载体；

12、将所述第一单靶点敲除载体与如seq id no.5和seq id no.6所示核苷酸序列进行扩增，得到扩增产物；

13、s4.将所述第二退火产物连入经限制性内切酶esp3i酶切后呈线性化的慢病毒表达载体，得到第二单靶点敲除载体；

14、限制性内切酶ecor i酶切所述第二单靶点敲除载体，得到酶切产物；

15、s5.连接所述扩增产物与所述酶切产物，制得所述牛txnip基因双靶点敲除载体。

16、可选地，步骤s1中，所述退火包括：95℃温度下处理2min，随后每8s下降0.1℃，降至25℃，约90min，于4℃暂时保存。

17、可选地，步骤s1中，如seq id no.1核苷酸序列与seq id no.2所示核苷酸序列的摩尔比为1：1。

18、可选地，步骤s2中，所述退火包括：95℃温度下处理2min，随后每8s下降0.1℃，降至25℃，约90min，于4℃暂时保存。

19、可选地，步骤s2中，如seq id no.3核苷酸序列与seq id no.4所示核苷酸序列的摩尔比为1：1。

20、可选地，步骤s3中，所述第一退火产物与所述线性化的慢病毒表达载体的摩尔比为3-10：1。

21、可选地，步骤s5中，所述扩增产物与所述酶切产物的质量比为50-100：50-100。

22、第三个方面，本发明提供一种细胞系，采用如上所述牛txnip基因双靶点敲除载体和/或根据如上所述的方法构建得到的牛txnip基因双靶点敲除载体与pmd2.g、pspax2质粒共转染293ft细胞进行慢病毒的包装，48小时后收集病毒上清并感染牛乳腺上皮细胞，经嘌呤霉素筛选得到。

23、第四个方面，本发明提供如上所述牛txnip基因双靶点敲除载体和/或根据如上所述的方法构建得到的牛txnip基因双靶点敲除载体和/或如上所述细胞系在牛txnip功能研究中的应用。

24、本发明的有益效果在于：

25、相较于单靶点敲除载体而言，本发明的双靶点敲除载体具有更高的灵活性，能够提高打靶效率，减少脱靶效应。

技术特征：

1.一种牛txnip基因双靶点敲除载体，其特征在于，包括慢病毒表达载体、连接在所述慢病毒表达载体上的靶向牛txnip编码区的第一sgrna序列以及连接在所述慢病毒表达载体上的靶向txnip编码区的第二sgrna序列，所述第一sgrna序列对应的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示，所述第二sgrna序列对应的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如seq id no.3和seq id no.4所示。

2.如权利要求1所述的牛txnip基因双靶点敲除载体，其特征在于，所述第一sgrna序列靶向牛txnip编码区的sgrna56位点。

3.如权利要求1所述的牛txnip基因双靶点敲除载体，其特征在于，所述第二sgrna序列靶向牛txnip编码区的sgrna231位点。

4.如权利要求1所述的牛txnip基因双靶点敲除载体，其特征在于，所述慢病毒表达载体选自慢病毒表达载体。

5.如权利要求4所述的牛txnip基因双靶点敲除载体，其特征在于，所述慢病毒表达载体选自plv3-u6-mcs-sgrna-cas9-egfp-puro（plv3）。

6.如权利要求1-5任一项所述牛txnip基因双靶点敲除载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.如权利要求6所述的牛txnip基因双靶点敲除载体的构建方法，其特征在于，步骤s1中，所述退火包括：95℃温度下处理2min，随后每8s下降0.1℃，降至25℃，约90min，于4℃暂时保存；

8.如权利要求6所述的牛txnip基因双靶点敲除载体的构建方法，其特征在于，步骤s3中，所述第一退火产物与所述线性化的慢病毒表达载体的摩尔比为3-10：1；

9.一种细胞系，其特征在于，采用如权利要求1-5任一项所述牛txnip基因双靶点敲除载体和/或根据权利要求6-8任一项所述的方法构建得到的牛txnip基因双靶点敲除载体与pmd2.g、pspax2质粒共转染293ft细胞进行慢病毒的包装，48小时后收集病毒上清并感染牛乳腺上皮细胞，经嘌呤霉素筛选得到。

10.如权利要求1-5任一项所述牛txnip基因双靶点敲除载体和/或根据权利要求6-8任一项所述的方法构建得到的牛txnip基因双靶点敲除载体和/或如权利要求9所述细胞系在牛txnip功能研究的应用。

技术总结
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种牛TXNIP基因双靶点敲除载体、构建方法及其应用。该TXNIP基因双靶点敲除载体包括慢病毒表达载体、连接在慢病毒表达载体上的靶向牛TXNIP编码区的第一sgRNA序列以及连接在慢病毒表达载体上的靶向TXNIP编码区的第二sgRNA序列，第一sgRNA序列对应的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，第二sgRNA序列对应的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。相较于单靶点敲除载体而言，本发明的牛TXNIP基因双靶点敲除载体具有更高的灵活性，能够提高打靶效率，减少脱靶效应。

技术研发人员：王玲,吴晓婷,罗宗刚,许贤吉,张龚炜,周迪,杨蓉
受保护的技术使用者：西南大学
技术研发日：
技术公布日：2025/1/13