本发明涉及外泌体原料药制备，具体为一种高纯度外泌体原料药的制备方法。
背景技术：
1、公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
2、随着再生医学的发展，外泌体的应用得到越来越多关注，外泌体是由不同类型细胞分泌的圆形的细胞外膜囊泡，具有特定的脂质和蛋白质，大小在30～120nm 之间，几乎所有哺乳动物细胞都能分泌的囊泡，它具有脂质双分子层膜结构，呈典型的杯状形态，通常包含蛋白质、脂质、mrna、microrna等功能分子，广泛存在于各种体液中，如血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁等，外泌体参与细胞间物质交换和信息传递，调节免疫反应、肿瘤侵袭、细胞增殖等生物学行为，具备成为治疗相关疾病的药物载体生物原料药的天然优势和巨大潜力，但是，受限于外泌体所处体液环境的成分复杂性和外泌体自身的纳米级尺寸尺寸，从各种体液中分离获取高纯度和功能结构完整性的外泌体仍具有很大挑战性。
3、目前，常用的外泌体分离提纯方法有超速离心法(uc)、免疫亲和法、聚合物沉淀法、纳米膜过滤法、尺寸排阻色谱法等。其中超速离心法(uc)是外泌体分离提纯的黄金标准，但是该方法耗时长、产量低，依赖于昂贵的精密仪器设备，同时多次的超速浓缩可能会损坏外泌体的结构完整性，不利于外泌体的下游分析应用。基于外泌体尺寸、密度、溶解度等物理特性的其它分离技术也存在产量低、纯度低、耗时较长等问题。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种高纯度外泌体原料药的制备方法，以解决上述背景技术中提出的外泌体在分离提纯时成本高，耗时长，同时容易破坏外泌体的形态结构和生理功能，破坏外泌体结构的完整性，不利于外泌体下游分析的问题。本发明提出的一种高纯度外泌体原料药的制备方法，包括以下步骤：
2、s1：取新鲜血浆，置于采集管中，按每5ml血浆加20μl的比例加入溶液a，轻微颠倒混匀，并放置一段时间；
3、s2：将s1得到的溶液进行分离，取上清即为血清，取上清置于离心管中，重复离心一次，吸取上清放置备用；
4、s3：通过注射器吸取上述离心后的血清，滤器过滤后，转移至新的离心管备用；
5、s4：取经活化的strep-tagii蛋白纯化磁珠，加入饱合偶联用量的抗cd63，于室温下混合一段时间；
6、s5：将s4得到的溶液进行分离缓冲液清洗，清洗完成后，加入氨基酸进行脱水缩合；
7、s6：将s5得到的溶液加入适量的分离缓冲液悬浮，最终形成磁珠悬浮液；
8、s7：将s6得到的磁珠悬浮液中加入5倍s3中得到的溶液，并进行孵育；
9、s8：孵育完成后的体系用溶液b清洗，磁力架分离磁珠，即得到吸附有外泌体的复合物；
10、s9：将s8得到的复合物与400μl洗脱液混合，室温震荡，然后进行分离，取上清，即为高纯度外泌体原料药。
11、优选的，所述s1中，溶液a为血液促凝剂，静置时间为30min。
12、优选的，所述s2中，分离温度4°c、分离因素3000g、分离时间5分钟。
13、优选的，所述s4中，所述抗cd63抗体与所述strep-tagii蛋白纯化磁珠之间的质量比为1：5。
14、优选的，所述s5中，所述分离缓冲液为含0.1％牛血清白蛋白的磷酸缓冲盐溶液；优选地，所述分离缓冲液事先以0.22微米滤膜过滤除菌。
15、优选的，所述s6中，所述分离缓冲液的用量为磁珠悬液体积的50-500倍。
16、优选的，所述s7中，孵育温度37°c，孵育器参数为颠倒旋转90°，倾斜5秒，5°震动持续1秒，孵育时间2小时。
17、优选的，所述s8中，所述溶液b为磷酸缓冲盐溶液。
18、优选的，所述s9中，所述洗脱液为ph2.8～3.5的甘氨酸溶液，甘氨酸浓度0.1～0.2mol/l，震荡时间30min，分离因素3000g、分离时间5分钟。
19、优选的，所述s1-s9中，对于每次得到的结果进行检测、记录并上传至追溯系统。
20、与现有技术相比，本发明的有益效果是：
21、本发明通过strep tag ii的羧基和适配体上的氨基脱水缩合，将streptag ii标记到适配体上，随后通过strep tag ii和磁珠表面的链霉亲和素的特异性结合作用，生成外泌体捕获工具—cd63适配体-磁珠偶联物，相比于现有免疫磁珠法中繁琐的三步磁珠修饰过程，耗时约10h，本发明中磁珠修饰仅需两步，耗时约2h，过程简单，用时短；
22、本发明使用的cd63适配体可以特异性识别外泌体表面的cd63特征蛋白，有效克服常规的外泌体富集技术存在的对脂蛋白等杂质共分离的缺陷，极大提升富集外泌体的纯度，并且可以保证分离外泌体的完整度；
23、本发明使用脱氧核糖核酸酶dnase破坏cd63适配体结构，或基于生物素溶液、strep-tag ii与strep-tactin间的竞争性结合作用以达到无损释放回收磁珠表面吸附外泌体的目的，外泌体的回收率可达90％以上；
24、本发明使用cd63适配体代替传统免疫磁珠法中所使用的cd63抗体。相比于cd63抗体，cd63适配体可以在体外快速批量合成、成本低廉；而且适配体不易受外部温度、ph等环境因素的影响，性能更加稳定可靠，因此该发明可以大大降低外泌体分离提纯操作的经济成本，同时提高实验结果的稳定性和可重复性；
25、本发明应用生物原料药生产质量控制体系并结合溯源系统，确保外泌体原料药制剂生产的安全有效可控。
1.一种高纯度外泌体原料药的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种高纯度外泌体原料药的制备方法，其特征在于：所述s1中，溶液a为血液促凝剂，静置时间为30min。
3.根据权利要求1所述的一种高纯度外泌体原料药的制备方法，其特征在于：所述s2中，分离温度4°c、分离因素3000g、分离时间5分钟。
4.根据权利要求1所述的一种高纯度外泌体原料药的制备方法，其特征在于：所述s4中，所述抗cd63抗体与所述strep-tagii蛋白纯化磁珠之间的质量比为1：5。
5.根据权利要求1所述的一种高纯度外泌体原料药的制备方法，其特征在于：所述s5中，所述分离缓冲液为含0.1％牛血清白蛋白的磷酸缓冲盐溶液；优选地，所述分离缓冲液事先以0.22微米滤膜过滤除菌。
6.根据权利要求1所述的一种高纯度外泌体原料药的制备方法，其特征在于：所述s6中，所述分离缓冲液的用量为磁珠悬液体积的50-500倍。
7.根据权利要求1所述的一种高纯度外泌体原料药的制备方法，其特征在于：所述s7中，孵育温度37°c，孵育器参数为颠倒旋转90°，倾斜5秒，5°震动持续1秒，孵育时间2小时。
8.根据权利要求1所述的一种高纯度外泌体原料药的制备方法，其特征在于：所述s8中，所述溶液b为磷酸缓冲盐溶液。
9.根据权利要求1所述的一种高纯度外泌体原料药的制备方法，其特征在于：所述s9中，所述洗脱液为ph2.8～3.5的甘氨酸溶液，甘氨酸浓度0.1～0.2mol/l，震荡时间30min，分离因素3000g、分离时间5分钟。
10.根据权利要求1所述的一种高纯度外泌体原料药的制备方法，其特征在于：所述s1-s9中，对于每次得到的结果进行检测、记录并上传至追溯系统。