一种心脏类器官的构建方法与流程

本发明涉及类器官构建，尤其涉及一种心脏类器官的构建方法。

背景技术：

1、心脏是人体的重要器官，它的基本功能是推动血液流动，向器官、组织提供充足的血流量，以供应氧和各种营养物质，并带走代谢的终产物，使细胞维持正常的代谢和功能。血管疾病，如心肌梗死和心力衰竭，已成为全球死亡的主要原因。随着人类年龄的增长，心脏功能下降给人类健康带来了沉重的负担。深入研究心血管疾病的发病机制、提高心血管疾病的诊疗水平以及开发新型药物成为学者们关注的焦点。

2、长期以来，二维细胞模型和动物模型一直被用来研究心血管疾病。然而，这些传统模型都有着自身局限性，并不完全适用于心血管疾病的研究。如2d细胞模型无基质成分和器官特异性功能，以及在多次传代后原始细胞的遗传异质性逐渐丧失。动物模型与人类之间存在种属差异性，具有不同的结构和生理学，并且具有不同的特异性器官发育和发病机制。

3、相比于上述两种研究模型，类器官作为一种新的体外细胞模型，具有复杂三维细胞结构，它显示出与体内器官相似的结构和功能。心脏类器官是对传统心血管疾病模型的有效补充，在体外更真实和准确地反映人体心脏的生物学特性和功能，使其在疾病机制研究、药物开发、精准医疗和再生医学等领域具有广泛应用前景和独特优势。目前已报道过一些由人诱导多能干细胞(ips)构建心脏类器官的方法，但这些方法步骤较为复杂，至少需要依次采用3种培养基进行多阶段分化培养，且构建心脏类器官所需时间较长。例如专利cn118345031a中需要一次使用三种培养基，进行三个阶段分化培养，才能由人诱导多能干细胞构建得到心脏类器官，步骤较为复杂，总培养时长需要19.5天左右，且在进行三个阶段分化培养之前，需要先形成ips细胞球并维持其细胞球形态，使类器官构建过程进一步复杂化，操作难度较高。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，即现有的由人诱导多能干细胞构建心脏类器官的方法步骤复杂，且所需时间较长，操作难度较大，本发明提供了一种心脏类器官的构建方法。在本发明的方法中，依次使用2种培养基进行两个阶段分化培养，即可由消化后离散的人诱导多能干细胞构建得到心脏类器官，简化了心脏类器官的构建过程，缩短了构建时间，并降低了操作难度。

2、本发明的具体技术方案为：

3、一种心脏类器官的构建方法，包括以下步骤：

4、s1：配制含cd脂质(cd lipid)、胰岛素-转铁蛋白-硒-氨基乙醇(its-x)、l-抗坏血酸-2-磷酸(l-aa2p)、1-硫代甘油(α-mtg)、胰岛素(insulin)、成纤维细胞生长因子2(fgf2)和糖原合成酶激酶-3β(gsk-3β)抑制剂的培养基i；

5、s2：配制含cd脂质、胰岛素-转铁蛋白-硒-氨基乙醇、l-抗坏血酸-2-磷酸、1-硫代甘油、胰岛素、成纤维细胞生长因子2和血管内皮生长因子a(vegfa)的培养基ii；

6、s3：将人诱导多能干细胞团消化后，悬浮于培养基i中，再接种至孔底为u形的超低吸附细胞培养板中，培养36～40h时，去除培养基i，加入培养基ii，培养至形成心脏类器官。

7、在由人诱导多能干细胞构建类器官的过程中，培养基中的各种成分会对细胞的生长和分化产生错综复杂的影响。本发明依次采用含有特定成分的培养基i和培养基ii进行培养，并在特定的时间点(即采用培养基i培养36～40h时)将培养基i换成培养基ii，能够成功构建得到心脏类器官。采用本发明的方法，仅需使用两种培养基，培养11.5天左右(第一阶段分化培养36h左右，第二阶段分化培养10天左右)，即可由人诱导多能干细胞构建获得心脏类器官，简化了心脏类器官的构建步骤，缩短了构建时间；并且，在本发明的方法中，心脏类器官可由消化后离散的人诱导多能干细胞构建得到，无需在使用培养基i进行培养前，使人诱导多能干细胞预先形成细胞球并保持细胞球的形态，这能够在更大程度上简化心脏类器官的构建过程，降低操作难度。

8、作为优选，步骤s1具体包括：将cd脂质、胰岛素-转铁蛋白-硒-氨基乙醇、l-抗坏血酸-2-磷酸、1-硫代甘油、胰岛素、成纤维细胞生长因子2和糖原合成酶激酶-3β抑制剂加入到dmem/f12培养基中，混匀，得到培养基i。

9、作为优选，步骤s2具体包括：将cd脂质、胰岛素-转铁蛋白-硒-氨基乙醇、l-抗坏血酸-2-磷酸、1-硫代甘油、胰岛素、成纤维细胞生长因子2和血管内皮生长因子a加入到dmem/f12培养基中，混匀，得到培养基ii。

10、作为优选，步骤s1中，所述培养基i中，cd脂质、胰岛素-转铁蛋白-硒-氨基乙醇、l-抗坏血酸-2-磷酸、1-硫代甘油、胰岛素、成纤维细胞生长因子2和糖原合成酶激酶-3β抑制剂的浓度分别为0.5×～2×、0.5×～2×、100～200ng/ml、350～450μm、1～5μg/ml、10～30ng/ml和1～10μm。

11、作为优选，步骤s2中，所述培养基ii中，cd脂质、胰岛素-转铁蛋白-硒-氨基乙醇、l-抗坏血酸-2-磷酸、1-硫代甘油、胰岛素、成纤维细胞生长因子2和血管内皮生长因子a的浓度分别为0.5×～2×、0.5×～2×、100～200ng/ml、350～450μm、1～5μg/ml、10～30ng/ml和100～200ng/ml。

12、培养基i和培养基ii中各成分的浓度会影响细胞的生长和分化，进而影响心脏类器官的形成。本发明发现，当两种培养基中1-硫代甘油的浓度不在350～450μm范围内时，会造成心脏类器官构建效果不佳。

13、作为优选，步骤s3中，采用干细胞消化液消化人诱导多能干细胞团。

14、作为优选，步骤s3中，所述人诱导多能干细胞团的制备方法包括以下步骤：将人诱导多能干细胞团接种至培养基中，培养至细胞密度达到73～78％。

15、作为优选，步骤s3中，悬浮于培养基i中的人诱导多能干细胞团按照0.5×104～1.0×104个/cm2的细胞密度接种至孔底为u形的超低吸附细胞培养板中。

16、作为优选，步骤s3中，所述培养至形成心脏类器官的时间为240～280h。

17、作为优选，步骤s3中，所述培养至形成心脏类器官的过程中，每45～50h更换一次培养基ii。

18、与现有技术相比，本发明具有以下优点：

19、(1)本发明中，通过采用特定的培养基成分以及更换培养基的时机，能够在仅依次使用2种培养基进行两个阶段分化培养的情况下，由消化后离散的人诱导多能干细胞构建得到心脏类器官，能够简化心脏类器官的构建过程，缩短构建时间，降低操作难度。

20、(2)本发明中，通过控制两种培养基中各成分的浓度，能够使各成分之间较好地配合，使细胞按照理想的情况生长和分化，实现较好的心脏类器官构建效果。

技术特征：

1.一种心脏类器官的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的心脏类器官的构建方法，其特征在于，步骤s1具体包括：将cd脂质、胰岛素-转铁蛋白-硒-氨基乙醇、l-抗坏血酸-2-磷酸、1-硫代甘油、胰岛素、成纤维细胞生长因子2和糖原合成酶激酶-3β抑制剂加入到dmem/f12培养基中，混匀，得到培养基i。

3.根据权利要求1所述的心脏类器官的构建方法，其特征在于，步骤s2具体包括：将cd脂质、胰岛素-转铁蛋白-硒-氨基乙醇、l-抗坏血酸-2-磷酸、1-硫代甘油、胰岛素、成纤维细胞生长因子2和血管内皮生长因子a加入到dmem/f12培养基中，混匀，得到培养基ii。

4.根据权利要求1或2所述的心脏类器官的构建方法，其特征在于，步骤s1中，所述培养基i中，cd脂质、胰岛素-转铁蛋白-硒-氨基乙醇、l-抗坏血酸-2-磷酸、1-硫代甘油、胰岛素、成纤维细胞生长因子2和糖原合成酶激酶-3β抑制剂的浓度分别为0.5×~2×、0.5×~2×、100~200 ng/ml、350~450 μm、1~5 μg/ml、10~30 ng/ml和1~10 μm。

5.根据权利要求1或3所述的心脏类器官的构建方法，其特征在于，步骤s2中，所述培养基ii中，cd脂质、胰岛素-转铁蛋白-硒-氨基乙醇、l-抗坏血酸-2-磷酸、1-硫代甘油、胰岛素、成纤维细胞生长因子2和血管内皮生长因子a的浓度分别为0.5×~2×、0.5×~2×、100~200 ng/ml、350~450 μm、1~5 μg/ml、10~30 ng/ml和100~200 ng/ml。

6.根据权利要求1所述的心脏类器官的构建方法，其特征在于，步骤s3中，采用干细胞消化液消化人诱导多能干细胞团。

7.根据权利要求1所述的心脏类器官的构建方法，其特征在于，步骤s3中，所述人诱导多能干细胞团的制备方法包括以下步骤：将人诱导多能干细胞团接种至培养基中，培养至细胞密度达到73~78%。

8.根据权利要求1所述的心脏类器官的构建方法，其特征在于，步骤s3中，悬浮于培养基i中的人诱导多能干细胞团按照0.5×104~1.0×104个/cm2的细胞密度接种至孔底为u形的超低吸附细胞培养板中。

9.根据权利要求1所述的心脏类器官的构建方法，其特征在于，步骤s3中，所述培养至形成心脏类器官的时间为240~280 h。

10.根据权利要求1所述的心脏类器官的构建方法，其特征在于，步骤s3中，所述培养至形成心脏类器官的过程中，每45~50 h更换一次培养基ii。

技术总结
本发明涉及类器官构建技术领域，公开了一种心脏类器官的构建方法，包括以下步骤：配制含CD lipid、ITS‑X、L‑AA2P、α‑MTG、胰岛素、FGF2和GSK‑3β抑制剂的培养基I；配制含CD lipid、ITS‑X、L‑AA2P、α‑MTG、胰岛素、FGF2和VEGFA的培养基II；将人诱导多能干细胞团消化后，悬浮于培养基I中，再接种至孔底为U形的超低吸附细胞培养板中，培养36~40 h时，去除培养基I，加入培养基II，培养至形成心脏类器官。在本发明的方法中，依次使用2种培养基进行两个阶段分化培养，即可由消化后离散的人诱导多能干细胞构建得到心脏类器官，简化了心脏类器官的构建过程，缩短了构建时间，并降低了操作难度。

技术研发人员：李伟,赵婧,张勇,李春启,蒋明
受保护的技术使用者：杭州环特生物科技股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2025/3/6