一株多杀性巴氏杆菌荚膜突变株及其应用

本发明属于微生物领域，具体涉及一株多杀性巴氏杆菌(pasteurellamultocida)荚膜突变株。

背景技术：

1、多杀性巴氏杆菌(pm)是一种可引起多种动感染发病的革兰阴性小杆菌，也有人感染的病例报道。pm荚膜是其重要的毒力因子，主要起到菌体保护和免疫逃避的作用。根据荚膜不同pm分为a、b、d、e和f共5个血清型，血清型间免疫交叉保护作用较弱，加之细菌类菌苗免疫保护效果总体不及病毒性疾病的疫苗，pm感染引起的败血症和隐性感染威胁着一直是我国畜牧养殖业的健康发展，在养兔业领域更是如此。目前该病预防使用的疫苗仍是以细菌灭活苗为主，很多报道显示自家苗的免疫保护效果高于商品化细菌灭活苗，至今具体原因并不清楚，很可能与pm的变异、株间差异、血清型等很多因素有关。早期研究报道不同动物感染的pm的荚膜血清型存在偏爱性，但是近些年不同血清型的pm都在同种畜禽中被分离鉴定，我国学者已经在感染家兔中分离到a型、d型和f型pm菌株。在我国严控药物滥用和减少抗生素使用的背景下，随着畜牧养殖业的发展，新型高效疫苗的研发一直是研究热点但进展相对较慢，快速科学的血清学监测技术研究在pm感染控制和净化方面具有重要的现实意义。

2、elisa检测技术因良好的特异性和敏感性、高通量性和以商品化具有广阔的前景。但是目前在pm的elisa检测技术研究和应用方面，都是以pm菌体抗原作为包被原或者以人工表达的某种菌体蛋白的重组蛋白为包被原进行检测，某种蛋白作为包被原无法充分反应检测样品中全部菌体蛋白抗体的情况，菌体抗原无论完整菌体或者破碎菌体作为包被原无法解决荚膜成分对包被效果的影响以及包被前菌株保存和培养过程中毒力带来的生物安全风险。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题为：提供一株多杀性巴氏杆菌(pasteurellamultocida)荚膜突变株rpmf2019s及其应用。

2、本发明的技术方案为：一株多杀性巴氏杆菌(pasteurella multocida)荚膜突变株rpmf2019s，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号cctcc no：m 20242234。

3、上述所述的荚膜突变株rpmf2019s作为巴氏杆菌抗体elisa检测的包被抗原的用途。

4、上述所述的荚膜突变株rpmf2019s在制备多杀性巴氏杆菌疫苗中的应用。

5、一种试剂盒，含有上述所述的荚膜突变株rpmf2019s。

6、一种多杀性巴氏杆菌疫苗，含有灭活的上述所述的荚膜突变株rpmf2019s。

7、通过1年多约50次传代连续传代，获得多杀性巴氏杆菌(pm)野生株pmf0的荚膜突变株rpmf2019s(菌株保藏号cctcc m 20242234)，又经过近两年的连续传代突变株rpmf2019s得培养培养特性稳定。pmf0相比较，rpmf2019s菌落变小，菌落表面粘性下降；透射电镜观察菌体体表未见明显荚膜，荚膜定量结果显示荚膜产量减少；其生长速率减缓，抗盐、抗酸碱、抗渗透能力减弱，对温度更加敏感，对多种药物敏感不同程度的增加，毒力大大下降。攻毒试验显示，pmf0的ld50为7.5×106cfu，而高达2.42×1013cfu的rpmf2019s菌株菌液能仍未致死受试实验小鼠。这表明该菌株毒力大大减弱，培养特性比较稳定，生物安全风险较低，是较理想免疫用弱毒菌株的侯选菌株和免疫学检测方法的抗原候选。

8、通过全基因组测序发现rpmf2019s菌株和pmf0相比，phya-phyb-fcbe区段的缺失4577bp片段(包括完整的phya和phyb基因和部分fcbe片段)。通过qrt-pcr检测毒力基因得出hexa、hexc、pm0442等毒力基因表达量相较于pmf0下调极为显著，hexd和wzze的表达量没有显著变化，cya和oxyr的表达量上调极为显著。在rpmf2019s中外膜蛋白相关基因lolb、pal、hemr等基因相较于pmf0表达量下调极为显著，metq、plpe、bam等基因表达量下调显著，lola、lppb、bamd的表达量有所下降，ompa的表达量无明显变化。从基因水平证实了rpmf2019s菌株是荚膜结构缺失突变株，毒力显著下降。

9、制作pmf0与rpmf2019s灭活疫苗进行小鼠免疫实验，pmf0和rpmf2019s作为包被原，抗大肠杆菌小鼠阳性血清、抗沙门菌的小鼠阳性血清的检测结果均为阴性，鼠抗rpmf2019s血清和鼠抗pmf0血清的结果均为阳性。以pmf0为包被原和以rpmf2019s作为包被原进行elisa检测鼠抗rpmf2019s血清的od值均高于相应鼠抗pmf0血清的od值，表明rpmf2019s具有更良好的免疫效果，以rpmf2019s作为包被原进行的鼠抗rpmf2019s血清和鼠抗pmf0血清的检测od值均高于以pmf0为包被原的检测值，表明rpmf2019s作为包被原的更具有优势性。

10、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

11、本发明通过长期人工培养获得pm荚膜缺失变异菌株，该菌株毒力大大减弱，培养特性比较稳定，生物安全风险较低，是较理想免疫用弱毒菌株的侯选菌株和免疫学检测方法的抗原候选。

12、保藏信息：

13、多杀性巴氏杆菌(pasteurella multocida)荚膜突变株rpmf2019s，于2024年10月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号cctcc no：m 20242234。

技术特征：

1.一株多杀性巴氏杆菌(pasteurella multocida)荚膜突变株rpmf2019s，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号cctcc no：m 20242234。

2.权利要求1所述的荚膜突变株rpmf2019s作为多杀性巴氏杆菌抗体elisa检测的包被抗原的用途。

3.权利要求1所述的荚膜突变株rpmf2019s在制备多杀性巴氏杆菌疫苗中的应用。

4.一种试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的荚膜突变株rpmf2019s。

5.一种多杀性巴氏杆菌疫苗，其特征在于，含有灭活的权利要求1所述的荚膜突变株rpmf2019s。

技术总结
本发明公开了一株多杀性巴氏杆菌荚膜突变株及其应用，属于微生物领域，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC M 20242234。小鼠免疫攻毒试验和Pm菌株抗体检测间接ELISA方法的检测试验表明，RPmF2019s具有更良好的免疫效果且作为Pm检测ELISA方法包被原更具优势性。

技术研发人员：杨泽晓,杨德操,陈弟诗,王印,罗燕,姚学萍,罗逊,李丽,任梅渗,徐秋梅
受保护的技术使用者：四川农业大学
技术研发日：
技术公布日：2025/2/10