碱性蛋白酶突变体及其在皮革脱毛中的应用

本发明属于微生物与基因工程，具体涉及碱性蛋白酶突变体及其在皮革脱毛中的应用。

背景技术：

1、制革涉及一系列复杂的操作，包括浸泡、脱脂、脱毛、浸酸和铬糅等，其中，脱毛被认为是污染最严重的工段。脱毛是从动物皮上除去毛和表皮的工序，目前应用最为广泛的方法是硫化钠（na2s）脱毛，其原理是na2s溶于水产生氢氧化钠（naoh）和硫氢化钠（nahs），naoh可以溶解毛孔中的交联物质，而nahs的还原作用可以瓦解毛发蛋白的二硫键，使得毛发溶解，进而达到较好的脱毛效果。但是，上述方法中na2s的使用会释放出有毒的硫化氢（h2s）气体，使得废水中氨氮（nh3-n）、生物需氧量（bod）、化学需氧量（cod）、硫化物、总溶解固体（tds）、总悬浮物（tss）等环境指标均偏高。

2、为改变上述现状，酶法脱毛因满足清洁生产、环保节能得以迅速发展。在酶法脱毛过程中，蛋白酶能够高效专一的水解毛孔中的交联物质，破坏毛根与毛孔、毛球与毛乳头间的连接力，进而达到脱毛的目的。与na2s脱毛相比，酶法脱毛不仅能大幅度降低废水中的nh3-n、bod、cod等指标，还能回收到高质量、完整的毛发，提高成革质量。然而，由于酶对胶原蛋白具有水解作用，酶法脱毛易使动物皮面受到伤害，甚至烂皮，削弱皮革的物理机械性能。有研究表明，使用氯化钠（nacl）等金属盐对动物皮进行防腐处理后再进行酶法脱毛，盐能够使动物皮的胶原蛋白得到充分保护，克服现有酶法脱毛易导致的皮面伤害、烂皮及皮革性能削弱的缺陷。但是，由于现有蛋白酶适应性不强且耐盐碱能力弱，用于经盐处理的动物皮脱毛中酶活会受到抑制，导致脱毛效率严重降低，脱毛时间往往长达4 h及以上。

技术实现思路

1、基于现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种酶活力和稳定性均显著提高的碱性蛋白酶突变体，该突变体能耐受制革工艺的复杂环境，对nacl具有较强的耐受性，应用于经浓度≤100 g/l的nacl防腐处理的盐湿羊皮脱毛中，在40-50℃、ph 7-9条件下，脱毛时间缩短至1.5-2 h。

2、为达到上述目的，本发明采用的第一个技术方案为：

3、一种碱性蛋白酶突变体，所述碱性蛋白酶突变体的氨基酸序列如seq id no.4所示。

4、本发明采用的第二个技术方案为：

5、编码上述碱性蛋白酶突变体的基因。

6、本发明采用的第三个技术方案为：

7、一种重组载体，其特征在于，包含上述碱性蛋白酶突变体的编码基因。

8、优选的，所述载体为pwb980。

9、本发明采用的第四个技术方案为：

10、一种重组工程菌，包含上述重组载体。

11、优选的，所述重组工程菌的宿主菌为枯草芽孢杆菌wb600。

12、本发明采用的第五个技术方案为：

13、上述碱性蛋白酶突变体在皮革脱毛中的应用。

14、优选的，所述皮革为经浓度≤100g/l的nacl防腐处理的盐湿动物皮。

15、优选的，所述动物皮包含羊皮、牛皮、猪皮中任一种。

16、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

17、1、本发明通过在体外对来源于 virgibacillus byunsanensis的碱性蛋白酶和来源于 ornithinibacillus caprae的碱性蛋白酶进行定向进化，得到酶活力和稳定性均显著提高的碱性蛋白酶突变体，并在工程菌枯草芽孢杆菌wb600中实现该碱性蛋白酶突变体编码基因的活性胞外表达，所获得的碱性蛋白酶突变体重组工程菌经发酵培养后，从发酵产物中可分离纯化得到目标碱性蛋白酶突变体。

18、2、本发明碱性蛋白酶突变体在ph 10、温度50℃时活性达到87.33 u/ml，显著高于来源于 virgibacillus byunsanensis的碱性蛋白酶（36.27 u/ml）和来源于 ornithinibacillus caprae的碱性蛋白酶（53.14 u/ml）。

19、3、本发明碱性蛋白酶突变体的最适反应温度为45℃，最适ph为8，在ph 8、温度50℃以下或温度45℃、ph 7-9条件下孵育12 h其残余酶活力可保持在90%以上，具有较好的热稳定性和ph稳定性。

20、4、本发明碱性蛋白酶突变体对nacl具有较强的耐受性，在45℃、ph 8、以及0-100g/l nacl条件下孵育12 h其残余酶活力可保持在95%以上，应用于皮革脱毛中，羊皮经浓度≤100 g/l的nacl防腐处理后再进行脱毛处理，在ph 7-9、40-50℃条件下脱毛时间缩短至1.5-2 h。

技术特征：

1.碱性蛋白酶突变体，其特征在于，所述碱性蛋白酶突变体的氨基酸序列如seq idno.4所示。

2.编码如权利要求1所述碱性蛋白酶突变体的基因。

3.重组载体，其特征在于，包含权利要求2所述的基因。

4.如权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述载体为pwb980。

5.重组工程菌，其特征在于，包含权利要求3或4所述的重组载体。

6.如权利要求5所述的重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌的宿主菌为枯草芽孢杆菌wb600。

7.如权利要求1所述碱性蛋白酶突变体在皮革脱毛中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述皮革为经浓度≤100 g/l的nacl防腐处理的盐湿动物皮。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述动物皮包含羊皮、牛皮、猪皮中任一种。

技术总结
本发明属于微生物与基因工程技术领域，具体涉及一种碱性蛋白酶突变体及其在皮革脱毛中的应用。本发明通过在体外对来源于Virgibacillus byunsanensis的碱性蛋白酶和来源于Ornithinibacillus caprae的碱性蛋白酶进行定向进化，得到酶活力和稳定性均显著提高的碱性蛋白酶突变体，并在工程菌枯草芽孢杆菌WB600中实现该突变体编码基因的活性胞外表达。本发明碱性蛋白酶突变体的最适反应温度为45℃，最适pH值为8，在pH 8、温度50℃以下或温度45℃、pH 7‑9条件下孵育12 h后其残余酶活力可保持在90%以上，具有较好的热稳定性和pH稳定性，且对NaCl具有较强的耐受性，应用于经浓度≤100 g/L的NaCl防腐处理的盐湿羊皮脱毛中，在pH 7‑9、40‑50℃条件下，脱毛时间缩短至1.5‑2 h。

技术研发人员：田永强,蒋光阳,陈佳
受保护的技术使用者：四川大学
技术研发日：
技术公布日：2024/12/17