一种用于鉴定柔弱浒苔的分子标记、引物探针组及其应用的制作方法

本发明属于分子标记，具体涉及一种用于鉴定柔弱浒苔的分子标记、引物探针组及其应用。

背景技术：

1、近岸海域绿潮频发，已成为世界性的海洋生态环境问题。近年来发生的绿潮灾害中发现一个石莼属绿藻新种，命名为柔弱浒苔（ ulva delicatissima），其主要形态学特征为：藻体亮绿色，柔弱纤长，高<10cm，固着器由基部细胞延长的假根状丝体组成，假根不发达。藻体为单层细胞中空管状结构，主枝不明显，直径70~400μm，通常低于1mm，无气囊，分枝多而细密，极易断裂，分枝4~5次，主枝直径大于次级分枝，藻体末枝的顶端通常为单列细胞，单列细胞数量可达30个，直径10~18μm。表面观，藻体细胞呈长方形或方形，细胞长14~35，宽10~25µm，高12~25µm，细胞呈明显纵向排列，色素体不充满，主枝基部细胞排列不规则。横切面观，体腔由4~76个细胞围成，细胞呈长方形或卵圆形，体壁厚10~25μm，色素体集中在细胞内靠体腔外缘一侧，淀粉核2~4个。传统的绿藻分类主要依据叶状体形态学特征，由于石莼属绿藻具有很强的形态可塑性，多种藻类仅通过传统的形态学分类方法难以区分。随着分子生物学的快速发展，近年来石莼属绿藻分类鉴定多采用形态学和分子标记测序比对相结合的方法。目前常用于石莼属绿藻鉴定的分子标记包括：its、rbcl、tufa和18s，由于单一分子标记的分辨率有限，常需多个分子标记联合使用；另外由于自然环境复杂、样本杂质去除困难、引物通用性等问题经常产生非特异性扩增，导致测序失败，且鉴定过程需要进行pcr扩增、扩增产物电泳检测、切胶回收、测序、序列比对分析等，操作复杂、成本高、所需时间长。另外，环境中微观繁殖体的传统检测方法为实验室培养后对叶状体进行统计、部分采样开展形态学和分子生物学鉴定，所需时间长，工作量大。

2、因此，发掘柔弱浒苔的特异性分子标记，开发一种快速有效的鉴别柔弱浒苔的鉴定方法对指导柔弱浒苔绿潮灾害防控具有重要意义。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于鉴定柔弱浒苔的分子标记，该分子标记特异性强，能够用于鉴定柔弱浒苔。

2、本发明的另一目的还在于提供一种用于鉴定柔弱浒苔的引物探针组，该引物组的分辨率极高，稳定性强，探针特异性强，能够快速、有效的进行柔弱浒苔物种鉴定及环境dna定量检测。

3、为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

4、本发明提供了一种用于鉴定柔弱浒苔的分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如seq id no.1所示。

5、本发明还提供了一种用于鉴定柔弱浒苔的引物探针组，所述引物探针组根据所述的分子标记设计上游引物、下游引物和荧光探针；所述上游引物的核苷酸序列如seq idno.2所示；所述下游引物的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述荧光探针的核苷酸序列如seq id no.4所示。

6、本发明还提供了一种用于鉴定柔弱浒苔的试剂盒，所述试剂盒包括所述的分子标记和引物探针组。

7、本发明还提供了一种所述的分子标记或所述的引物探针组或所述的试剂盒在鉴定柔弱浒苔中的应用。

8、本发明还提供了一种柔弱浒苔的鉴定方法，包括如下步骤：

9、提取待测样本的基因组dna；

10、以上述样本的基因组dna为模板，利用所述的引物探针组或所述的试剂盒进行进行qpcr扩增；反应结束后，根据扩增曲线情况和ct值判断待测样本中柔弱浒苔是否为阳性。

11、优选地，所述待测样本为植物样本或环境样本。

12、优选地，所述qpcr扩增的反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，55~63℃退火、延伸60s，40个循环；每个循环后测荧光强度。

13、优选地，所述qpcr扩增的反应体系以25μl计为：dna模板2μl，2×pcr mix 12.5μl，10μm上游引物1μl，10μm下游引物1μl，10μm荧光探针0.5μl，灭菌双蒸水8μl。

14、优选地，当待测样本为植物样本时鉴定的标准如下：若检测未出现扩增曲线或ct值>标准系列中100copy时的ct值，则待测样本为非柔弱浒苔；若检测ct值≤标准系列中100copy时的ct值，则待测样本为柔弱浒苔。

15、优选地，当待测样本为环境样本时鉴定的标准如下：若检测未出现扩增曲线或ct值>标准系列中10copy时的ct值，则待测样本中不含有柔弱浒苔；若检测ct值≤标准系列中10copy时的ct值，则待测样本中含有柔弱浒苔。

16、本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：

17、本发明利用烟台北部绿潮主要原因种柔弱浒苔（ ulva.delicatissima）特征性5s核糖体rna基因序列（5s rdna）作为分子标记，通过设计特异性引物和taqman探针，确定最优pcr反应条件，可通过实时荧光定量pcr（qpcr）技术快速鉴定藻体样本，通过qpcr方法可在5~8h内快速、高效鉴定绿藻是否是柔弱浒苔，环境样本中是否含有柔弱浒苔微观繁殖体或dna。本发明构建的鉴定方法比常规方法更可靠、便捷，对于柔弱浒苔绿潮优势种鉴定以及由该绿藻引发的绿潮灾害预警、绿潮成因研究方面具有重要的指导意义。

技术特征：

1.一种用于鉴定柔弱浒苔的分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如seqid no.1所示。

2.一种用于鉴定柔弱浒苔的引物探针组，其特征在于，所述引物探针组根据权利要求1所述的分子标记设计上游引物、下游引物和荧光探针；所述上游引物的核苷酸序列如seqid no.2所示；所述下游引物的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述荧光探针的核苷酸序列如seq id no.4所示。

3.一种用于鉴定柔弱浒苔的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的分子标记和权利要求2所述的引物探针组。

4.权利要求1所述的分子标记或权利要求2所述的引物探针组或权利要求3所述的试剂盒在鉴定柔弱浒苔中的应用。

5.一种柔弱浒苔的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：

6.根据权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于，所述待测样本为植物样本或环境样本。

7.根据权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于，所述qpcr扩增的反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，55~63℃退火、延伸60s，40个循环；每个循环后测荧光强度。

8.根据权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于，所述qpcr扩增的反应体系以25μl计为：dna模板2μl，2×pcr mix 12.5μl，10μm上游引物1μl，10μm下游引物1μl，10μm荧光探针0.5μl，灭菌双蒸水8μl。

9.根据权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于，当待测样本为植物样本时鉴定的标准如下：若检测未出现扩增曲线或ct值>标准系列中100copy时的ct值，则待测样本为非柔弱浒苔；若检测ct值≤标准系列中100copy时的ct值，则待测样本为柔弱浒苔。

10.根据权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于，当待测样本为环境样本时鉴定的标准如下：若检测未出现扩增曲线或ct值>标准系列中10copy时的ct值，则待测样本中不含有柔弱浒苔；若检测ct值≤标准系列中100copy时的ct值，则待测样本中含有柔弱浒苔。

技术总结
本发明提供了一种用于鉴定柔弱浒苔的分子标记、引物探针组及其应用，涉及分子标记技术领域。本发明所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明以柔弱浒苔5S核糖体RNA基因序列作为分子标记，通过设计特异性引物和荧光探针，确定最优PCR反应条件，可通过实时荧光定量PCR技术快速鉴定藻体样品，也可对微观繁殖体样品、环境DNA样品进行检测，比常规方法更可靠、便捷，对于柔弱浒苔绿潮优势种鉴定以及由该绿藻引发的绿潮灾害预警、绿潮成因研究方面都具有重要意义。

技术研发人员：刘丽娟,王玮云,程玲,刘小静,王文君,姜向阳,姜会超,李正茂,高晨,何健龙,宋秀凯,姜炜
受保护的技术使用者：山东省海洋资源与环境研究院（山东省海洋环境监测中心、山东省水产品质量检验中心）
技术研发日：
技术公布日：2024/12/23