一种宽谱嗜冷黄杆菌噬菌体溶菌素的制备方法与应用

本发明属于噬菌体溶菌素，具体涉及一种宽谱嗜冷黄杆菌噬菌体溶菌素的制备方法与应用。

背景技术：

1、嗜冷黄杆菌(flavobacteriumpsychrophilum)是鲑科鱼类的易感致病菌，其导致的细菌性冷水病通常造成鱼体尾部糜烂、背鳍损伤、脾脏肿大、肠炎、腹水与死亡。近年研究显示鲤、鲫、香鱼等非鲑科鱼类也受到该病原菌的侵害。特定条件下，嗜冷黄杆菌的致死率高达90％。嗜冷黄杆菌的水平与垂直传播能力加剧了细菌性冷水病的流行，对水产养殖业造成的经济损失不容忽视。

2、集约化水产养殖生产了全球鱼类消费量的一半以上，然而，其可持续发展也面临着多重挑战。由于养殖密度过大以及管理方式不科学等问题使得鱼类发生病害的频率越来越高。除采用消毒剂对水体消毒外，抗生素药物也被大量使用以防控水产养殖过程中细菌性疾病的暴发。药物残留导致的环境污染与食品安全问题一直备受社会各界的高度关注。针对细菌性冷水病，抗生素干预疗法不仅增加了养殖成本，并且有产生嗜冷黄杆菌耐药菌株的风险。与耐多药细菌的迅速出现相比，新型抗生素的研发显得十分缓慢。因此，开发替代性抗菌药物是后抗生素时代的重要任务。噬菌体编码的溶菌素具有裂解宿主细菌细胞的功能以释放新组装的噬菌体。肽聚糖层作为细菌细胞膜高度保守的组分是噬菌体溶菌素的主要靶标。鉴于溶菌素独特的靶向机制和对细菌细胞膜的破坏能力，有望成为应对当前耐多药细菌危机的一种新型的、有效的替代传统抗生素的治疗手段。

3、多个针对革兰氏阳性细菌的溶菌素作为新型抗菌药物已进入临床试验阶段。然而，由于细菌细胞壁结构的不同，革兰氏阴性细菌外膜的存在阻碍了外源应用的溶菌素进入肽聚糖层发挥裂解作用。除了寻找天然具有穿透外膜能力的溶菌素外，与穿膜肽融合表达，与外膜透膜剂如edta、triton等联合也是常见的提高溶菌素透膜性的方法。只有克服外膜屏障扩大噬菌体溶菌素在革兰氏阴性细菌中的应用才能充分挖掘溶酶素在对抗耐多药细菌中的潜力。

4、虽然硝基呋喃类以及磺胺类药物可防控地理分布广泛且水生宿主繁多的嗜冷黄杆菌，但是这些药物被禁用于食用鱼类。噬菌体溶菌素作为新型抗菌剂在水产养殖业细菌性疾病防控中的应用未见相关报道。目前，多数市售酶制剂禁止反复冻融，耐受ph范围有限，且存在低温条件下酶活性差，高温时却易失活等问题。因此，开发具有宽ph耐受范围，反复冻融后在复杂的水域条件下仍具有活性的溶菌素对水产养殖业的可持续发展具有十分重要意义。

5、本发明成功实现了嗜冷黄杆菌噬菌体溶菌素ely-174在大肠杆菌中的异源表达，获得的溶菌素ely-174不仅产量高、杀菌活力强、ph耐受范围广、裂解谱宽，而且可以耐受一定浓度的氯化钠，具有盐碱水域使用的潜力。溶菌素ely-174除了能够应用于水产养殖业的疾病预防外，在水产品消毒与保鲜等方面也具有潜在的应用价值与经济价值。然而，目前尚没有该方面的相关报道。

技术实现思路

1、本发明解决的技术问题是提供了一种具有宽谱裂解能力的宽谱嗜冷黄杆菌噬菌体溶菌素的制备方法与应用。

2、本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种宽谱嗜冷黄杆菌噬菌体溶菌素的制备方法，其包括构建表达具有体外裂解能力的宽谱嗜冷黄杆菌噬菌体溶菌素工程菌株和嗜冷黄杆菌噬菌体溶菌素ely-174的制备及纯化，其具体步骤为：

3、步骤s1：合成病毒病源数据库所获得的嗜冷黄杆菌噬菌体溶菌素ely-174编码基因片段；

4、步骤s2：以合成的溶菌素ely-174编码基因片段为模板，利用引物fvp ely-174 f和fvp ely-174 r扩增ely-174基因片段，所用引物如下：

5、fvp ely-174 f：gcgcgagctcatgaccagagcaaataaagtaaagtac；

6、fvp ely-174 r：gcgcaagcttctaatggtgatggtgatgatgtctatt；

7、步骤s3：将扩增得到的溶菌素ely-174基因片段利用限制性核酸内切酶sac i、hind iii双酶切后与表达载体pet-29b连接，获得的重组质粒，命名为pet-29b-ely-174，通过热激转化法将重组质粒转入大肠杆菌dh5α感受态细胞中，经过筛选与测序，获得重组菌株，命名为ely-174-dh5α；

8、步骤s4：通过热激转化法将测序正确的pet-29b-ely-174重组质粒转入大肠杆菌bl21感受态细胞中，获得最终的表达菌株，命名为ely-174-bl21；

9、步骤s5：经过两次活化表达菌株ely-174-bl21，并将其转接到lb培养基中，在37℃条件下120rpm摇床培养至od600＝0.6-0.8，添加异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)后在16℃条件下90rpm摇床继续培养20h，获得表达有溶菌素ely-174的菌液；

10、步骤s6：将获得的菌液在6000rpm、4℃条件下离心，收集菌体沉淀，再用50mm、ph＝7.4的pbs缓冲液重悬菌体沉淀后超声破碎，工作4s，休息8s，共99个循环，将破碎后的菌液条件下离心15min，收集的上清液即为溶菌素ely-174粗酶液；

11、步骤s7：破碎后的粗酶液经镍亲和层析柱纯化分离，最终得到纯化的目的蛋白即嗜冷黄杆菌噬菌体溶菌素，命名为ely-174。

12、优选地，所述嗜冷黄杆菌噬菌体溶菌素ely-174的氨基酸序列为yp_008320451.1，源自ncbi数据库。

13、本发明所述的嗜冷黄杆菌噬菌体溶菌素ely-174在制备宽裂解谱生物酶制剂中的应用。

14、本发明所述的嗜冷黄杆菌噬菌体溶菌素ely-174用于在体外裂解嗜冷黄杆菌及拟杆菌门的其它部分细菌。

15、本发明所述的嗜冷黄杆菌噬菌体溶菌素ely-174用于在复杂条件下裂解病原菌，其中复杂条件是指在含有50mm nacl的缓冲液与含有10wt％牛血清的反应体系，或指模拟水产养殖过程中不同水域环境以及在水生动物出现溃烂、创面时的复杂条件。

16、本发明所具有的独特优点和显著效果体现如下：

17、1、本发明制备的溶菌素ely-174应用范围不局限于病原菌嗜冷黄杆菌，还可用于水产养殖业拟杆菌门其它病原菌的预防，在水产品消毒与保鲜等方面也有应用潜力。

18、2、本发明制备的溶菌素ely-174在-20℃存储条件下反复冻融6次后仍具有裂解能力，表明其稳定性较强，便于长途运输与储藏。

19、3、本发明制备的溶菌素ely-174ph耐受范围广，可适用于多种水质条件下水产养殖过程中疾病的防治，也可用于水产品的污染防控等。

技术特征：

1.一种宽谱嗜冷黄杆菌噬菌体溶菌素的制备方法，其特征在于包括构建表达具有体外裂解能力的宽谱嗜冷黄杆菌噬菌体溶菌素工程菌株和嗜冷黄杆菌噬菌体溶菌素ely-174的制备及纯化，其具体步骤为：

2.根据权利要求1所述的宽谱嗜冷黄杆菌噬菌体溶菌素的制备方法，其特征在于：所述嗜冷黄杆菌噬菌体溶菌素ely-174的氨基酸序列为yp_008320451.1，源自ncbi数据库。

3.根据权利要求1所述的方法制备的嗜冷黄杆菌噬菌体溶菌素ely-174在制备宽裂解谱生物酶制剂中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述嗜冷黄杆菌噬菌体溶菌素ely-174用于在体外裂解嗜冷黄杆菌及拟杆菌门的其它部分细菌。

5. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述嗜冷黄杆菌噬菌体溶菌素ely-174用于在复杂条件下裂解病原菌，其中复杂条件是指在含有50mm nacl的缓冲液与含有10wt%牛血清的反应体系，或指模拟水产养殖过程中不同水域环境以及在水生动物出现溃烂、创面时的复杂条件。

技术总结
本发明公开了一种宽谱嗜冷黄杆菌噬菌体溶菌素的制备方法与应用，通过异源表达获得了高产量和高活性的嗜冷黄杆菌噬菌体溶菌素Ely‑174。该溶菌素Ely‑174不仅能够快速裂解嗜冷黄杆菌，而且也可裂解拟杆菌门其它细菌。溶菌素Ely‑174在4℃条件下保存30天后仍有75.7%裂解能力；‑20℃存储条件下反复冻融6次后10min内裂解活性为92%。溶菌素Ely‑174的耐酸碱、耐盐、耐血清特性可适用于复杂的水域环境。除防控水产养殖业的细菌病害外，溶菌素Ely‑174在水产品消毒与保鲜等方面也具有极大的应用潜力。

技术研发人员：谢帅帅,路遥雅洁,曹香林,陈建军
受保护的技术使用者：河南师范大学
技术研发日：
技术公布日：2025/3/3