Cas12f核酸酶突变体、其应用及试剂盒的制作方法

本发明专利涉及一种cas12f核酸酶突变体、其应用及试剂盒，属于生物。

背景技术：

1、crispr全称是clustered regularly interspaced short palindromic repeats（成簇的规律间隔的短回文重复序列），即很多条相同的小段，然后把它们均匀地插入了一段杂乱排列的dna一样。这些序列称为重复序列(repeat)，而把它们隔开的杂乱排列的dna称为间隔序列(spacer)。而cas的全称是crispr associated（crispr关联），其与crispr序列一起构成了crispr/cas系统。crispr/cas系统在疾病模型建立、抗癌药物研制、干细胞治疗等生物和医学等领域中有广泛的应用。

2、crispr/cas系统中，研究和使用最多的cas效应蛋白是cas9，但是，其因较大的分子尺寸（超过1000个氨基酸）而难以被腺相关病毒（aav）载体进行高效递送，从而限制了其在基因治疗等领域的应用。例如，腺相关病毒递送系统的最大承载量是4700个核苷酸，比编码酿脓链球菌（streptococcus pyogenes）cas9的基因（4200个核苷酸）长不了多少，导致没有空间组装其他调控元件。

3、为此，研究人员积极寻找“体格”比较小，但仍能发挥“剪刀”功能的cas效应蛋白。其中最紧凑的一类crispr效应核酸酶cas12f（400-700个氨基酸）因其较小的分子量备受关注。目前，关于核酸酶cas12f研究相对较少，本申请通过对其进行突变，以期望进一步提高其性能。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种cas12f核酸酶突变体，具有更高的体外切割活性。

2、本发明采用的技术方案为：

3、一种cas12f核酸酶突变体，为如下a1-a3酶突变中任一所述的蛋白质：

4、a1：在氨基酸序列如seq id no.2所示的cas12f核酸酶的基础上进行如下位点中的一个或多个任意突变：115、119、180、364、401、447；这些位点都是cas12f核酸酶与sgrna/dsdna结合区域的位点，优化这些位点氨基酸残基的电荷，从野生型氨基酸残基的中性或酸性突变为碱性或中性，提高两者的结合能力；

5、a2：将a1所示的氨基酸序列经过除前述突变以外的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有基本相同的切割效率的蛋白质；

6、a3：与a1的蛋白质具有90%以上的序列同一性，或至少有95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.8%序列同一性，且切割效率与a1的蛋白质基本相当的蛋白质。

7、优选的，所述的突变选自q115l、e119l、s180r、i364k、t386k、e393a、e401a或e447k中的一个或多个组合。 这些位点都是cas12f核酸酶与sgrna/dsdna结合区域的位点，优化这些位点氨基酸残基的电荷，从野生型氨基酸残基的中性或酸性突变为碱性或中性，提高两者的结合能力。

8、优选的，还包括标签，所述标签用于分离纯化和/或追踪cas12f核酸酶的功能域、肽或蛋白。更优选的，所述标签为组氨酸(his)标签、v5标签、 flag标签、流感血凝素(ha)标签、myc标签、vsv-g标签、硫氧还蛋白(trx)标签。 荧光蛋白,例如绿色荧光蛋白(gfp)、黄色荧光蛋白(yfp)、青色荧光蛋白(cfp)、蓝色荧光蛋白(bfp)、hcred和dsred; 谷胱甘肽-s-转移酶(gst)、辣根过氧化物酶(hrp)或荧光素酶等报告蛋白。

9、本发明中的突变的描述是本领域技术人员认同的突变描述，以其中一个位点的突变示例，q115l，指的是seq id no:2所示的氨基酸序列的第115位的谷氨酰胺（q）突变为了亮氨酸（l），即第115位的谷氨酰胺（q）被亮氨酸（l）替代。

10、本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可以通过本领域已知的任何方法计算百分比序列同一性，例如使用 blosum62 matrix，参照henikoff等人在p nas,  89 (22):10915-10919 (1992)中描述的方法。

11、上述的cas12f核酸酶突变体的编码基因。

12、上述的cas12f核酸酶突变体的表达载体或者宿主菌。

13、上述的cas12f核酸酶突变体在体外进行基因编辑中的应用。

14、本发明还公开了一种组合物或试剂盒，含有上述的cas12f核酸酶突变体。

15、本发明还公开了一种基因编辑试剂盒，含有上述的cas12f核酸酶突变体。

16、本发明还公开了一种切割靶核酸的方法，使靶核酸与上述的cas12f核酸酶突变体、组合物或试剂盒接触。

17、本发明在野生型cas12f核酸酶的基础上进行突变，获得的突变体相较于野生型而言，切割效率明显提升，平均提升1.3-2.2 倍不等，更适合进行基因编辑，提升编辑效率。

技术特征：

1.一种cas12f核酸酶突变体，其特征在于，为如下的蛋白质：

2.根据权利要求1所述的cas12f核酸酶突变体，其特征在于，还包括标签，所述标签用于分离纯化和/或追踪cas12f核酸酶的功能域、肽或蛋白。

3.根据权利要求2所述的cas12f核酸酶突变体，其特征在于，所述标签为his标签、v5标签、 flag标签、ha标签、myc标签、vsv-g标签、trx标签、荧光蛋白、gst、hrp或荧光素酶。

4.权利要求1-3中任一项所述的cas12f核酸酶突变体的编码基因。

5.权利要求1-3中任一项所述的cas12f核酸酶突变体的表达载体或者宿主菌。

6.权利要求1-3中任一项所述的cas12f核酸酶突变体在体外基因编辑中的应用。

7.一种组合物或试剂盒，其特征在于含有权利要求1-3中任一项所述的cas12f核酸酶突变体。

8.一种基因编辑试剂盒，其特征在于含有权利要求1-3中任一项所述的cas12f核酸酶突变体或权利要求4所述的编码基因。

9.一种切割靶核酸的方法，其特征在于使靶核酸与权利要求1-3中任一项所述的cas12f核酸酶突变体、权利要求7所述的组合物或试剂盒接触。

技术总结
本发明提供了一种Cas12f核酸酶突变体，在氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的Cas12f核酸酶的基础上进行如下位点中的一个或多个任意突变：115、119、180、364、401、447。还公开了其编码基因、表达载体、宿主菌、试剂盒和应用。本发明在野生型Cas12f核酸酶的基础上进行突变，获得的突变体相较于野生型而言，切割效率明显提升，平均提升1.3‑2.2倍不等，更适合进行基因编辑，提升编辑效率。

技术研发人员：刘想,刘雪,唐琼卫
受保护的技术使用者：镁孚泰生物科技（上海）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/12/23