一种杏梅系梅花叶片愈伤组织的遗传转化方法

本发明涉及植物基因工程，具体涉及一种杏梅系梅花叶片愈伤组织的遗传转化方法。

背景技术：

1、梅花（ prunus mumesieb. et. zucc.）是蔷薇科李属木本植物，作为中国传统名花之一，在我国已有3000多年的引种栽培历史，在我国园林的生态应用中有着重要地位和文化内涵。梅花按其种源组成可分为真梅系、杏梅系和樱李梅系，其中杏梅系梅花是梅花与杏的种间杂交种。梅花应用范围广泛，是重要的早春观花植物，也可作食用、药用等，具有较高的观赏价值和经济价值。

2、为了培育抗性强、观赏价值高的梅花品种应用于园林绿化，需开展梅花品种的选育和改良。但在品种选育过程中，一般都采取常规杂交育种技术，育种周期较长和效率低。植物基因工程的发展为梅花育种提供了新的途径，但目前梅花高效遗传转化体系还处于初步研究阶段，且复杂木本植物难以建立高效的遗传转化体系。目前尚缺少行之有效的杏梅系梅花叶片愈伤组织的遗传转化方法。

3、有鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供了一种杏梅系梅花叶片愈伤组织的遗传转化方法。

2、具体的，本发明的技术方案如下：

3、第一方面，本发明提供了一种梅花的遗传转化方法，其以叶片为外植体，经愈伤组织诱导、侵染培养和筛选，得到转化成功的愈伤组织；其中，所述愈伤组织诱导使用的培养基配方包括：1.0±0.2mg/l的6-ba，1.0±0.2mg/l的tdz和0.5±0.1mg/l的2,4-d。

4、优选地，愈伤组织诱导使用的培养基配方以wpm为基础培养基，还包括30±5g/l的蔗糖，7±1g/l的琼脂，ph值为5.8-6.0。

5、优选地，用于侵染的菌液od600值为0.7±0.1。

6、优选地，用于侵染的菌液为含有 ruby报告基因的农杆菌gv3101重悬液，重悬液成分包括：100±20μmol/l的乙酰丁香酮，ph5.8-6.0。

7、优选地，含有 ruby报告基因的农杆菌gv3101重悬液的制备方法包括：先将转化了带有 ruby报告基因的质粒的农杆菌gv3101在添加有75±5mg/l壮观霉素和50±5mg/l利福平的lb固体培养基中活化，挑取单克隆菌落；再在添加75±5mg/l壮观霉素和50±5mg/l利福平的lb液体培养基中扩繁；最后离心收集菌体后重悬。

8、优选地，侵染培养使用的培养基与所述愈伤组织诱导使用的培养基相同。

9、优选地，愈伤组织诱导和/或侵染培养的温度为22-26℃，黑暗培养。

10、优选地，筛选用培养基的配方包括：15±2mg/l的壮观霉素，100±5mg/l的特美汀。

11、优选地，外植体选用杏梅系梅花‘香瑞白’枝条上当年新发1-2个月的新鲜叶片。

12、优选地，外植体经消毒处理，所述消毒依次包括：用75±5%酒精浸泡消毒30±5s，用无菌水冲洗30±5s，用2-5%次氯酸钠溶液浸泡消毒10-15min，用无菌水冲洗5±2次。

13、第二方面，本发明提供了所述梅花的遗传转化方法在转基因梅花愈伤组织制备或梅花基因功能研究和梅花品种改良中的应用。

14、优选地，所述应用包括如下至少一种用于判断农杆菌是否成功转化的方法：

15、（1）裸眼观察，若愈伤组织为红色，则判断转化成功。

16、（2）使用核酸序列如seq id no.01~02所示的引物对进行pcr鉴定。

17、有益效果：

18、本发明提供了一种杏梅系梅花叶片愈伤组织的遗传转化方法，先制备梅花遗传转化受体，然后以 ruby基因为报告基因转化农杆菌制备侵染菌液，再经过愈伤组织侵染和共培养，最终筛选获得抗性愈伤组织。本发明提供的方法可通过观察或pcr检测的方式对抗性愈伤组织进行鉴定。本发明成功侵染梅花愈伤组织并获得有 ruby报告基因表达的红色愈伤组织，诱导率高，为梅花遗传转化体系的建立及遗传改良提供了良好基础。

技术特征：

1.梅花的遗传转化方法，其特征在于，以杏梅系梅花枝条上当年新发1-2个月的新鲜叶片为外植体，经愈伤组织诱导、侵染培养和筛选，得到转化成功的愈伤组织；其中，所述愈伤组织诱导使用的培养基配方包括：1.0±0.2mg/l的6-ba，1.0±0.2mg/l的tdz和0.5±0.1mg/l的2,4-d。

2.根据权利要求1所述梅花的遗传转化方法，其特征在于，愈伤组织诱导使用的培养基配方以wpm为基础培养基，还包括30±5g/l的蔗糖，7±1g/l的琼脂，ph值为5.8-6.0。

3.根据权利要求2所述梅花的遗传转化方法，其特征在于，用于侵染的菌液od600值为0.7±0.1。

4.根据权利要求3所述梅花的遗传转化方法，其特征在于，用于侵染的菌液为含有ruby报告基因的农杆菌gv3101重悬液，重悬液成分包括：100±20μmol/l的乙酰丁香酮，ph5.8-6.0。

5.根据权利要求4所述梅花的遗传转化方法，其特征在于，含有ruby报告基因的农杆菌gv3101重悬液的制备方法包括：先将转化了带有ruby报告基因的质粒的农杆菌gv3101在添加有75±5mg/l壮观霉素和50±5mg/l利福平的lb固体培养基中活化，挑取单克隆菌落；再在添加75±5mg/l壮观霉素和50±5mg/l利福平的lb液体培养基中扩繁；最后离心收集菌体后重悬。

6.根据权利要求5所述梅花的遗传转化方法，其特征在于，侵染培养使用的培养基与所述愈伤组织诱导使用的培养基相同。

7.根据权利要求6所述梅花的遗传转化方法，其特征在于，愈伤组织诱导和/或侵染培养的温度为22-26℃，黑暗培养。

8.根据权利要求7所述梅花的遗传转化方法，其特征在于，筛选用培养基的配方包括：15±2mg/l的壮观霉素，100±5mg/l的特美汀。

9.根据权利要求8所述梅花的遗传转化方法，其特征在于，外植体选用杏梅系梅花‘香瑞白’枝条上当年新发1-2个月的新鲜叶片；

10.权利要求1-9任一项所述梅花的遗传转化方法在转基因梅花愈伤组织制备或梅花基因功能研究和梅花品种改良中的应用；

技术总结
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种杏梅系梅花叶片愈伤组织的遗传转化方法。本发明先制备梅花遗传转化受体，然后以RUBY基因为报告基因转化农杆菌制备侵染菌液，再经过愈伤组织侵染和共培养，最终筛选获得抗性愈伤组织。本发明提供的方法可通过观察或PCR检测的方式对抗性愈伤组织进行鉴定。本发明成功侵染梅花愈伤组织并获得有RUBY报告基因表达的红色愈伤组织，诱导率高，为梅花遗传体系的建立及遗传改良提供了良好基础。

技术研发人员：孙丽丹,赵春旭,吴昊,李子葳,苗润田,蒙娟,张启翔,程堂仁
受保护的技术使用者：北京林业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/12/23