一种荧光探针及其制备方法和应用、一种细菌检测试剂盒及其检测方法

本发明涉及荧光探针，具体涉及一种荧光探针及其制备方法和应用、一种细菌检测试剂盒以及检测方法。

背景技术：

1、随着我国经济的快速发展，食品的数量和种类日益丰富，食品问题成为人们重点关注的对象，因此提高食品的质量和解决食品安全问题越来越成为世界共同关心的热点问题。在食品污染中，微生物污染现象最为常见，并且其危害程度最深，可引起诸如食物中毒、感染等危害。

2、大肠杆菌是人类和动物肠道中数目最多的一种革兰氏阴性菌，一般情况下对人体不会造成危害，但食用被大肠杆菌污染的食物会引起肠道内疾病并引发各种感染性疾病，因此开发先进有效的快速检测方法能避免大肠杆菌导致的食品安全污染，确保人民群众的身体健康。传统检测大肠杆菌的方法以多管发酵法和滤膜法为主，但两种方法都存在程序繁琐且费时费力的缺点，难以满足快速诊断食品中的大肠杆菌的需求。

3、近年来，荧光探针因选择性好、灵敏度高、操作简便且能够可视化检测活细胞中的生物分子而受到广泛的关注。例如，专利cn115490654a公开了一种检测携clb毒素大肠杆菌荧光探针的合成与应用，其能够实现对携clb毒素大肠杆菌的比色荧光双信号响应，但存在合成路线复杂的缺陷。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种荧光探针及其制备方法和应用、一种大肠杆菌检测试剂盒及其检测方法，本发明提供的荧光探针结构简单，合成路线短，对细菌(包括大肠杆菌和/或金黄色葡萄球菌)的检测具有高灵敏度和选择性。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种荧光探针，具有式i所示结构：

4、

5、本发明提供了上述技术方案所述的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

6、在第一有机碱存在条件下，3-羟基-3-甲基-2-丁酮与丙二腈进行成环反应，得到具有式1所示结构的2-(3-氰基-4,5,5-三甲基呋喃-2(5h)-亚甲基)丙二腈；

7、

8、在催化剂的作用下，所述具有式1所示结构的2-(3-氰基-4,5,5-三甲基呋喃-2(5h)-亚甲基)丙二腈与3-氯-4-羟基苯甲醛进行羟醛缩合反应，得到具有式2所示结构的(e)-2-(4-(3-氯-4-羟基苯乙烯基)-3-氰基-5,5-二甲基呋喃-2(5h)-亚甲基)丙二腈；

9、

10、在第二有机碱的作用下，所述具有式2所示结构的(e)-2-(4-(3-氯-4-羟基苯乙烯基)-3-氰基-5,5-二甲基呋喃-2(5h)-亚甲基)丙二腈与丙烯酰氯进行取代反应，得到具有式i所示结构的荧光探针。

11、优选的，所述第一有机碱包括乙醇钠；

12、所述成环反应包括：先在室温条件下反应0.5h，再在回流条件下反应2～4h。

13、优选的，所述催化剂包括哌啶；

14、所述缩合反应的温度为回流温度，时间为12～16h。

15、优选的，所述第二有机碱包括三乙胺；

16、所述取代反应的时间为1～3h。

17、本发明提供了上述技术方案所述的荧光探针或上述技术方案所述的制备方法制备得到的荧光探针在检测半胱氨酸中的应用。

18、本发明提供了上述技术方案所述的荧光探针或上述技术方案所述的制备方法制备得到的荧光探针在检测细菌中的应用，所述细菌为代谢产物中含有半胱氨酸的细菌。

19、优选的，所述细菌包括大肠杆菌和/或金黄色葡萄球菌。

20、本发明提供了一种细菌检测试剂盒，包括上述技术方案所述的荧光探针或上述技术方案所述的制备方法制备得到的荧光探针荧光探针。

21、本发明提供了一种细菌含量的检测方法，包括以下步骤：

22、对待测细菌溶液进行超声裂解，得到细菌裂解液；

23、将荧光探针、乙腈、细菌裂解液和pbs缓冲溶液混合，进行孵育，在583nm的激发波长下检测所得孵育液在620nm处的荧光强度；所述荧光探针为上述技术方案所述的荧光探针或上述技术方案所述的制备方法制备得到的荧光探针荧光探针；

24、根据所述荧光强度和标准曲线获得待测细菌溶液中细菌的含量；

25、所述标准曲线为细菌的浓度随620nm处荧光强度的线性标准曲线。

26、本发明提供了一种荧光探针，具有式i所示结构。本发明提供的荧光探针结构简单，具有红光发射的特点，同时，本发明提供的式i所示结构的荧光探针选择性的识别基团为半胱氨酸的最常见的识别基团—丙烯酰氯，因此本发明提供的荧光探针能够快速且高选择性地检测半胱氨酸(cys)。而半胱氨酸作为细菌如大肠杆菌或金黄色葡萄球菌的一种常见的代谢物，本发明通过荧光探针对cys的检测，进而实现对大肠杆菌或金黄色葡萄球菌代谢物cys检测，获得大肠杆菌或金黄色葡萄球菌浓度随荧光强度变化的情况。同时，本发明提供的荧光探针能够实现比色荧光双信号响应，即在大肠杆菌或金黄色葡萄球菌存在下，荧光探针溶液从淡黄色到紫色，荧光颜色为橙黄色到红色，在620nm处荧光开启响应信号。本发明提供的荧光探针对大肠杆菌或金黄色葡萄球菌的检测具有高灵敏度和选择性，能够实现食品中的大肠杆菌或金黄色葡萄球菌含量进行快速的检测，这为检测大肠杆菌或金黄色葡萄球菌和提高食品安全质量提供了新的指引方向；另外其优异的比色荧光双信号可以开发成相应的食品细菌含量测试剂盒，对生物化学、分析检测等领域都具有较大的实际应用价值。

27、本发明提供了上述荧光探针的制备方法，此法合成路线短，操作简单，成本低，易于实现工业化批量生产。

技术特征：

1.一种荧光探针，其特征在于，具有式i所示结构：

2.权利要求1所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述第一有机碱包括乙醇钠；

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述催化剂包括哌啶；

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述第二有机碱包括三乙胺；

6.权利要求1所述的荧光探针或权利要求2～5任意一项所述制备方法制备得到的荧光探针在检测半胱氨酸中的应用。

7.权利要求1所述的荧光探针或权利要求2～5任意一项所述制备方法制备得到的荧光探针在检测细菌中的应用，所述细菌为代谢产物中含有半胱氨酸的细菌。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述细菌包括大肠杆菌和/或金黄色葡萄球菌。

9.一种细菌检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的荧光探针或权利要求2～5任意一项所述制备方法制备得到的荧光探针。

10.一种细菌含量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

技术总结
本发明提供了一种荧光探针及其制备方法和应用、一种细菌检测试剂盒以及检测方法，属于荧光探针技术领域。本发明通过荧光探针对Cys的检测，实现对细菌代谢物Cys检测，获得细菌浓度随荧光强度变化的情况。同时，本发明提供的荧光探针能够实现比色荧光双信号响应，即在代谢物为Cys的细菌(大肠杆菌)存在下，荧光探针溶液从淡黄色到紫色，荧光颜色为橙黄色到红色。本发明提供的荧光探针对细菌的检测具有高灵敏度和选择性，能够实现食品中的细菌含量进行快速的检测，这为检测细菌和提高食品安全质量提供了新的指引方向；另外其优异的比色荧光双信号可以开发成相应的食品细菌含量测试剂盒，对生物化学、分析检测等领域都具有实际应用价值。

技术研发人员：吴萃艳,黄薇,李晗,俞俊磊,贾志舰
受保护的技术使用者：宁波工程学院
技术研发日：
技术公布日：2025/3/3