一种广谱高致病性弧菌噬菌体发酵培养工艺及应用的制作方法

本发明涉及水产养殖，尤其涉及一种广谱高致病性弧菌噬菌体发酵培养工艺及应用。

背景技术：

1、抗生素的使用已经引起耐药弧菌的产生，开发新型高效的弧菌抑制类产品具有重要意义。噬菌体具有高效、安全和环保的特点，可有效感染和杀灭耐药弧菌，是未来开发弧菌抑菌产品的重要方向，并且噬菌体疗法已被证明在水产养殖业中可有效防治弧菌引起的疾病。但针对高致病性弧菌，目前分离得到的噬菌体较少，更缺乏相关的培养工艺。

2、专利“一株针对高致病性弧菌及耐药弧菌的副溶血弧菌噬菌体及应用(专利申请号：202311054043.3)”中，分离得到一株针对高致病性副溶血弧的噬菌体，可用于耐药弧菌或高致病性弧菌的防治，但仍然需要分离更多高致病性弧菌噬菌体，以获得噬菌体鸡尾酒，从而更加高效的抑制高致病性弧菌病的发生。针对弧菌噬菌体的发酵培养，在“一种适用于弧菌噬菌体培养及筛选的培养基及方法”专利(申请号：cn202210908481.0)中，发明了一种副溶血弧菌噬菌体的培养方法，采用蔗糖替代盐离子，但对目前培养实验室分离的几株高致病性弧菌噬菌体，该培养基并未有效促进噬菌体效价的提升。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种广谱高致病性弧菌噬菌体发酵培养工艺及应用，解决了目前培养实验室分离的几株高致病性弧菌噬菌体效价在采用已知弧菌噬菌体发酵培养基时效价较低及在防治弧菌引起的疾病方面的效果不好的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供了一种广谱高致病性弧菌噬菌体发酵培养工艺，包括如下步骤：

3、在无菌条件下配制zwhv液体培养基，用于高致病性弧菌噬菌体的发酵培养；

4、将对数期的宿主菌按1:100的比例接种到zwhv液体培养基中，37℃、180r/min培养2小时后，以0.01moi的接种复数接入高致病性弧菌噬菌体hbp04，继续培养4小时；

5、在噬菌体接种并初步培养后，将培养温度调整至32℃，继续以200r/min的速度培养6小时，收获噬菌体发酵液；

6、培养结束后，通过离心和过滤步骤去除宿主菌和杂质，得到纯化的噬菌体悬液；

7、采用双层平板法测定纯化后噬菌体的效价，通过统计噬菌斑数量来评估噬菌体的浓度和活性，确保噬菌体质量；

8、根据初步发酵结果，对培养条件进行微调，以进一步提高噬菌体的效价和产量，同时评估不同培养基对噬菌体发酵效果的影响；

9、将优化后的噬菌体发酵工艺应用于弧菌防控试验中，通过统计幼虾的死亡率来评估噬菌体的实际应用效果。

10、其中，在“在无菌条件下配制zwhv液体培养基，用于高致病性弧菌噬菌体的发酵培养”中，所述方法包括如下步骤：

11、所述zwhv液体培养基的配方为每升含酵母粉10g、蛋白胨8g、甘油5ml、玉米淀粉5g、硫酸镁2g、氯化钠30g、l-精氨酸0.5g。

12、其中，在“培养结束后，通过离心和过滤步骤去除宿主菌和杂质，得到纯化的噬菌体悬液”中，所述方法包括：

13、从已完成发酵的高致病性弧菌噬菌体hbp04培养物中收集发酵液，所述发酵液是在优化后的所述zwhv液体培养基中；

14、将收集的噬菌体发酵液进行初步离心处理，使用离心机通过转速5000r/min进行离心，离心时间设定为8-10分钟，去除发酵液中的大颗粒杂质和未完全裂解的宿主菌细胞，离心后收集上清液；

15、将初步离心得到的上清液通过0.22微米的滤膜进行过滤，进一步去除残留的宿主菌细胞碎片、蛋白质和其他细小杂质；

16、验证经过离心和过滤步骤后得到的噬菌体悬液的纯度和效价，确保噬菌体悬液满足后续应用的要求。。

17、其中，在“采用双层平板法测定纯化后噬菌体的效价，通过统计噬菌斑数量来评估噬菌体的浓度和活性，确保噬菌体质量”中，所述包括如下步骤：

18、取纯化后的噬菌体悬液，将噬菌体悬液用噬菌体缓冲溶液进行10倍连续稀释，获得一系列不同浓度的噬菌体稀释液；

19、取各管稀释后的噬菌体悬液100μl，分别加入各100μl宿主菌悬液，混匀，加入0.7％的水琼脂，倒在lbs固体平板上，晃动平板，噬菌体与宿主菌充分接触；

20、将制备好的双层平板置于37℃培养箱中过夜培养；

21、观察并记录噬菌斑的形成情况，统计每个平板上的噬菌斑数量；

22、根据稀释倍数和噬菌斑数量，计算出原始噬菌体悬液中的噬菌体浓度；

23、通过比较不同稀释度下噬菌斑的数量，确定噬菌体的效价，即每毫升噬菌体悬液中包含的可感染噬菌体颗粒数。

24、其中，在“将优化后的噬菌体发酵工艺应用于弧菌防控试验中，通过统计幼虾的死亡率来评估噬菌体的实际应用效果”中，所述方法还包括如下步骤：

25、取样本200尾，随机分为5组，设置健康对照组、感染对照组、lbs液体组、弧菌液体组和zwhv液体组；

26、除健康对照组外，其他试验组加入高致病性弧菌hv009，使高致病弧菌的终浓度达到5×105cfu/ml，培养总体积均为5l，液面高度均20cm；

27、在lbs液体组、弧菌液体组和zwhv液体组按照终浓度为2×103pfu/ml加入对应液体培养基发酵获得的hbp04噬菌体；

28、试验组在同样养殖条件下培养7日，每日统计幼虾死亡情况。

29、一种广谱高致病性弧菌噬菌体的应用，适用于所述广谱高致病性弧菌噬菌体发酵培养工艺，高致病性弧菌噬菌体hbp04应用于弧菌病的防控。

30、本发明的一种广谱高致病性弧菌噬菌体发酵培养工艺及应用，包括如下步骤：在无菌条件下配制zwhv液体培养基，用于高致病性弧菌噬菌体的发酵培养；将对数期的宿主菌按1:100的比例接种到zwhv液体培养基中，37℃、180r/min培养2小时后，以0.01moi的接种复数接入高致病性弧菌噬菌体hbp04，继续培养4小时；在噬菌体接种并初步培养后，将培养温度调整至32℃，继续以200r/min的速度培养6小时，收获噬菌体发酵液；培养结束后，通过离心和过滤步骤去除宿主菌和杂质，得到纯化的噬菌体悬液；采用双层平板法测定纯化后噬菌体的效价，通过统计噬菌斑数量来评估噬菌体的浓度和活性，确保噬菌体质量；根据初步发酵结果，对培养条件进行微调，以进一步提高噬菌体的效价和产量，同时评估不同培养基对噬菌体发酵效果的影响；将优化后的噬菌体发酵工艺应用于弧菌防控试验中，通过统计幼虾的死亡率来评估噬菌体的实际应用效果，本专利以前期实验室分离得到高致病性弧菌为宿主菌，分离筛选得到一株高效裂解高致病性弧菌的噬菌体(hbp04)，并通过培养工艺的优化，使其效价由原来的108pfu/ml提高到1011～12pfu/ml，极大提高了噬菌体的效价，降低了生产成本，将有利促进高致病弧菌噬菌体hbp04在防控弧菌病上的应用。

技术特征：

1.一种广谱高致病性弧菌噬菌体发酵培养工艺，其特征在于，包括如下步骤：

2.如权利要求1所述的广谱高致病性弧菌噬菌体发酵培养工艺，其特征在于，在“在无菌条件下配制zwhv液体培养基，用于高致病性弧菌噬菌体的发酵培养”中，所述方法包括如下步骤：

3.如权利要求2所述的广谱高致病性弧菌噬菌体发酵培养工艺，其特征在于，在“培养结束后，通过离心和过滤步骤去除宿主菌和杂质，得到纯化的噬菌体悬液”中，所述方法包括：

4.如权利要求1所述的广谱高致病性弧菌噬菌体发酵培养工艺，其特征在于，在“采用双层平板法测定纯化后噬菌体的效价，通过统计噬菌斑数量来评估噬菌体的浓度和活性，确保噬菌体质量”中，所述包括如下步骤：

5.如权利要求1所述的广谱高致病性弧菌噬菌体发酵培养工艺，其特征在于，在“将优化后的噬菌体发酵工艺应用于弧菌防控试验中，通过统计幼虾的死亡率来评估噬菌体的实际应用效果”中，所述方法还包括如下步骤：

6.一种广谱高致病性弧菌噬菌体的应用，适用于如权利要求1至5中任一所述的广谱高致病性弧菌噬菌体发酵培养工艺，其特征在于，高致病性弧菌噬菌体hbp04应用于弧菌病的防控。

技术总结
本发明涉及水产养殖技术领域，具体涉及一种广谱高致病性弧菌噬菌体发酵培养工艺及应用，包括如下步骤：配制ZWHV液体培养基；将对数期的宿主菌接种到ZWHV液体培养基中，以0.01MOI的接种复数接入高致病性弧菌噬菌体hBP04；继续培养收获噬菌体发酵液；去除宿主菌和杂质，得到纯化的噬菌体悬液；测定纯化后噬菌体的效价，评估噬菌体的浓度和活性；根据初步发酵结果，对培养条件进行微调，同时评估不同培养基对噬菌体发酵效果的影响；用优化后的噬菌体发酵工艺生产高致病性弧菌噬菌体并应用于弧菌防控试验中，通过统计幼虾的死亡率来评估噬菌体的实际应用效果，通过培养工艺的优化，提高了噬菌体的效价，促进高致病弧菌噬菌体hBP04在防控弧菌病上的应用。

技术研发人员：杨航,张永记,邵伟,张晓妹,赵庆恩,陈飞飞,刘杰,吴晨,毛宇轩
受保护的技术使用者：湖北之微生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2025/1/28