一种基于GgeAgo的DNA分子克隆方法及其应用

本发明属于生物，具体涉及一种基于ggeago的dna分子克隆方法及其应用。

背景技术：

1、分子克隆技术在基因工程、临床诊断、畜牧养殖等各个领域发挥重要的作用。目前该技术主要是依赖于一些来源于细菌的识别特定dna序列并在识别位点处或附近切割dna的限制性酶，但它们大多仅识别短的dna序列(4-8个碱基对)，这极大地限制了它们在重组dna技术中的应用。

2、原核argonaute蛋白(pagos)是一类可由多种核酸引导的核酸酶，在向导和靶标特异性方面展示出高度的多样性，相较于其他大部分的核酸内切酶来说具有特异性高、无靶序列限制、反应成本低等优势，这些特性使科研人员产生了将pagos用作分子克隆工具的想法。而我们早期对嗜热原核生物来源ago的研究表明，有的pagos不仅可以在gdna的引导下特异性切割ssdna靶标，还可以在一对互补的gdna的引导下在体外切割dsdna并产生dsdna断裂。这一活性使得pago能被用作体外分子克隆的通用限制性核酸内切酶。

3、近年来分子克隆技术取得了较大的进步，但在克隆效率、成本控制、gc含量等方面仍然面临挑战。因此，将性质优良的新型原核argonaute核酸工具酶应用于分子克隆有助于解决上述问题，对于推动合成生物学的相关发展具有重大意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于针对现有核酸检测技术的上述不足之处，提供一种基于核酸内切酶ggeago的dna分子克隆方法及其应用，该方法主要是通过将上述ago核酸酶剪切质粒或dsdna的反应体系与基于重组的克隆装配方法(如t5克隆)联用，从而实现各种类型的分子克隆。

2、为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

3、本发明的第一方面是提供了一种基于ggeago的dna分子克隆方法，包括以下步骤：

4、s1、载体质粒被切割体系剪切；所述切割体系包括：

5、(a)向导核酸分子：gdna；

6、(b)可编程核酸内切酶ggeago或/和其突变体，所述可编程核酸内切酶ggeago来源于嗜热菌，其氨基酸序列如seq id no.1所示，所述的ggeago的突变体的氨基酸序列与seqid no.1有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；

7、(c)任选的质粒或dsdna靶标；

8、(d)反应缓冲液；

9、s2、载体质粒切割产物与具有同源区的外源片段混合后，采用基于重组的克隆方法进行装配；

10、s3、步骤s2所得的混合液转化大肠杆菌，生成重组质粒。

11、进一步的，所述同源区长度为15-45bp。

12、优选的，所述同源区长度为18-20bp。

13、进一步的，所述质粒或dsdna切割条件为70-75℃反应15-60min。

14、优选的，所述质粒或dsdna切割条件为70℃反应30min。

15、进一步的，所述任意待插入位点的gc含量为29％-64％。

16、进一步的，根据质粒或dsdna拟插入目标位点设计一对正、反向gdna，引导ggeago切割质粒或dsdna，所获得的切割产物直接用于dna片段插入。

17、进一步的，所述gdna为5’-磷酸化向导dna。

18、优选的，所述gdna为18nt的5’-磷酸化向导dna。

19、进一步的，步骤s3中，在混合液中加入t5外切酶体系，在冰水浴中完成对同源区的消化。

20、本发明的第二方面是提供一种用于将目标dna克隆到载体中的试剂盒，包含上述的切割体系或用于制备所述切割体系的试剂。

21、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

22、(1)本发明提供的一种基于ggeago的dna分子克隆方法，靶向范围广，特异性高，可实现定点插入。

23、(2)操作简便，质粒或dsdna切割产物无需额外的纯化步骤可直接用于外源基因片段的插入。

24、(3)可通过t5核酸外切酶消化同源臂实现无缝克隆。

25、(4)拟插入位点的gc含量为29％-64％时，克隆效率较高。

技术特征：

1.一种基于ggeago的dna分子克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的dna分子克隆方法，其特征在于，所述同源区长度为15-45bp。

3.如权利要求1所述的dna分子克隆方法，其特征在于，所述同源区长度为18-20bp。

4.如权利要求1所述的dna分子克隆方法，其特征在于，所述质粒或dsdna切割条件为70-75℃反应15-60min。

5.如权利要求1所述的dna分子克隆方法，其特征在于，所述质粒或dsdna切割条件为70℃反应30min。

6.如权利要求1所述的dna分子克隆方法，其特征在于，所述任意待插入位点的gc含量为29％-64％。

7.如权利要求1所述的dna分子克隆方法，其特征在于，根据质粒或dsdna拟插入目标位点设计一对正、反向gdna，引导ggeago切割质粒或dsdna，所获得的切割产物直接用于dna片段插入。

8.如权利要求7所述的dna分子克隆方法，其特征在于，所述gdna为5’-磷酸化向导dna。

9.如权利要求1所述的dna分子克隆方法，其特征在于，步骤s3中，在混合液中加入t5外切酶体系，在冰水浴中完成对同源区的消化。

10.用于将目标dna克隆到载体中的试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1所述的切割体系或用于制备所述切割体系的试剂。

技术总结
本发明属于生物技术领域，具体公开了一种基于GgeAgo的DNA分子克隆方法及其应用。该方法包括载体质粒被切割体系剪切；载体质粒切割产物与具有同源区的外源片段混合后，采用基于重组的克隆方法进行装配后转化大肠杆菌，生成重组质粒。该切割体系包括向导核酸分子和可编程核酸内切酶GgeAgo或/和其突变体，GgeAgo在向导核酸分子的引导下切割质粒使其线性化，加入带有同源区的拟插入外源片段，转化大肠杆菌后，实现将外源片段高效准确地插入目标质粒。本发明提供的分子克隆方法效率高，时间短，操作简便，有效降低由PCR带来的突变。本发明提供的分子克隆方法为基于Ago的分子克隆技术和DNA的合成与组装技术提供新思路。

技术研发人员：马立新,胡娇,李文强,王飞
受保护的技术使用者：湖北大学
技术研发日：
技术公布日：2025/4/6