一种高效安全的Aβ42变体抗菌肽及其应用

本发明属于生物，具体涉及一种高效安全的aβ42变体抗菌肽及其应用。

背景技术：

1、自从抗生素被发现以来，其对人类及动物的健康起到了重要的作用，对动物的生产及生长起到了重要的促进作用。但是，由于其耐药性、残留等问题越来越突出，越来越多的国家和地区都逐步禁止在动物饲料中添加抗生素，同时不断规范临床抗生素的使用。近年来，新的医用药物以及动物饲料中替代抗生素物质的研究成为人们关注和研究的热点。抗菌肽（antimicrobial peptides，amps）是先天免疫系统的组成部分，是一类具有很高临床应用潜力的药物，已被证明对多耐药（multiple drug resistance，mdr）菌株具有有效的抗菌活性。amps是自然界中的生物体对抗病原性入侵的关键成分，所有物种中都有发现。抗菌肽具有多种生物功能，再加上其广泛分布和多样性，使它们成为发现潜在新型先导药物的丰富来源。

2、由于存在大量的疏水氨基酸残基，与膜相互作用是淀粉样多肽的特征。肽的淀粉样变性与抗菌性之间存在一定的关系。与阿尔兹海默症（ad）相关的aβ淀粉样肽在大脑和周围组织中产生，是由β前体蛋白（app）通过蛋白酶解途径裂解成的长度为39-43个氨基酸的片段。其中，aβ42的神经元毒性更大，聚集性更强，形成aβ沉淀的核心。aβ42聚集体在聚集反应过程中表现出不同的结构特征，包括β-折叠含量和表面疏水性的变化，这些特征与其细胞毒性密切相关。最近有研究表明，aβ42具有抗微生物和抗菌活性，并可能在体内作为amp发挥作用，发挥先天免疫效应分子的作用。因其与典型抗菌肽具有相似的结构和作用机制，我们期望将aβ42改造成具有抗菌活性的抗菌肽。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种高效安全的aβ42变体抗菌肽及其应用。

2、研究表明来源于人脑的天然淀粉样肽aβ42对部分细菌具有一定的抗菌活性，但对一部分菌的抗菌效果不好（mic>50μm）。因此，本发明以aβ42淀粉样肽为基础，通过对其改造获得抗菌性能更高的变体，以作为新一代抗菌药物的有力备选。

3、本发明aβ42变体抗菌肽，以天然淀粉样肽aβ42（如序列seq id no:1所示）的淀粉样聚集区段序列（aβ42的第16个至第22个氨基酸）为基础，重复此聚集区段，并在其两端各加上3个精氨酸（相对其它氨基酸有更强的抑制聚集作用），以及在重复的两个聚集区段之间插入四氨基酸序列yngk（具有形成β-turn的强烈倾向并抑制淀粉样聚集），得到变体抗菌肽aβ-6r-yngk，其氨基酸序列如序列seq id no:2所示。

4、本发明aβ42变体抗菌肽，重复aβ42（如序列seq id no:1所示）的淀粉样聚集区段序列（aβ42的第16个至第22个氨基酸），并在其两端各加上5个精氨酸，以及在重复的两个聚集区段之间插入四氨基酸序列yngk，得到变体抗菌肽aβ-10r-yngk，其氨基酸序列如序列seq id no:3所示。

5、本发明aβ42变体抗菌肽，反向重复aβ42（如序列seq id no:1所示）的淀粉样聚集区段序列（aβ42的第16个至第22个氨基酸），并在其两端各加上3个精氨酸，以及在反向重复的两个聚集区段之间插入四氨基酸序列yngk，得到变体抗菌肽aβ-6r-yngk-f，其氨基酸序列如序列seq id no:4所示。

6、本发明aβ42变体抗菌肽，反向重复aβ42（如序列seq id no:1所示）的淀粉样聚集区段序列（aβ42的第16个至第22个氨基酸），并在其两端各加上5个精氨酸，以及在反向重复的两个聚集区段之间插入四氨基酸序列yngk，得到变体抗菌肽aβ-10r-yngk-f，其氨基酸序列如序列seq id no:5所示。

7、进一步，所述aβ42变体抗菌肽的c-端采用酰胺化修饰，n-端采用乙酰化修饰。

8、进一步，所述改造体抗菌肽aβ-6r-yngk和aβ-6r-yngk-f的分子量为3087.67da；aβ-10r-yngk和aβ-10r-yngk-f的分子量为3712.42da。

9、本发明aβ42变体抗菌肽在制备抗菌制剂及其相关制剂如抗癌制剂中的应用。

10、所述抗菌制剂对革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌均具有抑制和杀灭效果。具体包括表皮葡萄球菌、大肠杆菌、弗格森埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、英诺克李斯特菌、铜绿假单胞菌等。

11、对野生型和改造后的aβ42抗菌肽进行理化性能评估分析，所述理化性能评估分析包括最低抑菌浓度mic值、聚集动力学、二级结构分析、与膜相互作用分析、溶血活性分析以及抗癌活性分析。所述 mic值是抑制革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、表皮葡萄球菌、英诺克李斯特菌以及革兰氏阴性菌大肠杆菌、弗格森埃希菌、铜绿假单胞菌的最低浓度值；聚集动力学是将抗菌肽与硫黄素t（tht）孵育，抗菌肽聚集形成的β-折叠片能够特异性地与硫黄素t（tht）结合，从而使荧光强度发生变化，通过硫黄素t结合荧光强度的变化来指示形成的聚集体数量变化；二级结构分析是检测抗菌肽在pbs缓冲液和模拟膜环境的脂质体中的远紫外圆二色谱；与膜相互作用分析是通过扫描电镜检测抗菌肽与细菌孵育后细菌细胞膜的变化；溶血活性分析是通过抗菌肽破坏红细胞膜释放血红蛋白的活性来评价抗菌肽对正常哺乳动物细胞的杀伤作用；抗癌活性分析是通过抗菌肽抑制癌细胞生长的活性来评价抗菌肽对癌细胞的杀伤作用。

12、相较于现有技术，本发明的有益效果体现在：

13、本发明以现有天然淀粉样肽序列为基础，插入具特定结构和效应的序列（有强烈形成β-turn倾向性、抑制淀粉样聚集的yngk）和在两端添加有特定效应的序列（可抑制淀粉样聚集的连续3/5个arg）进行改造，通过人工合成获得短肽，测定所得系列短肽的抗菌活性等相关理化性质以评估其是否为amp及活性强度；本发明基于现有淀粉样肽序列和抗菌活性信息，对其进行理性设计改造，并通过实验进行验证，能够高效快速地优筛抗菌肽，解决目前抗菌肽获取难度大和抗菌效果差等问题。

14、本发明提供的改造抗菌肽有如下优点：该系列抗细菌多肽对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，具体包括表皮葡萄球菌、大肠杆菌、弗格森埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、英诺克李斯特菌、铜绿假单胞菌，均具有抑制和杀灭效果，具有良好的应用前景。本发明的改造抗菌肽可以用做制备抗菌药物（抗细菌的抑制剂，例如抗革兰氏阴性菌的抑制剂或抗革兰氏阳性菌的抑制剂）。因细菌细胞与癌细胞有很多相似性，很多抗菌肽也表现出抗癌活性，故本发明的改造抗菌肽的抗癌应用也在保护范围。

技术特征：

1.一种高效安全的aβ42变体抗菌肽，其特征在于：

2.权利要求1所述aβ42变体抗菌肽在制备抗菌制剂中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：

5.权利要求1所述aβ42变体抗菌肽在制备抗癌制剂中的应用。

技术总结
本发明公开了一种高效安全的Aβ42变体抗菌肽及其应用。本发明以现有天然淀粉样肽序列为基础，插入具特定结构和效应的序列（有强烈形成β‑turn倾向性、抑制淀粉样聚集的YNGK）和在两端添加有特定效应的序列（可抑制淀粉样聚集的连续3/5个Arg）进行改造，通过人工合成获得短肽，测定所得系列短肽的抗菌活性等相关理化性质以评估其是否为AMP及活性强度；本发明基于现有淀粉样肽序列和抗菌活性信息，对其进行理性设计改造，并通过实验进行验证，能够高效快速地优筛抗菌肽，解决目前抗菌肽获取难度大和抗菌效果差等问题。

技术研发人员：张学成,兰金丽,潘玉娇,祝敏,肖亚中
受保护的技术使用者：安徽大学
技术研发日：
技术公布日：2025/2/20