一种重组肉毒杆菌神经毒素表达菌株及其应用的制作方法

本发明属于生物，涉及一种重组肉毒杆菌神经毒素表达菌株及其应用。

背景技术：

1、重组肉毒毒素是指通过基因重组技术在非致病性宿主菌中表达的肉毒毒素蛋白。肉毒毒素（bont）是一种由肉毒杆菌及其相关物种产生的神经毒性蛋白，根据特定血清型分为a至g七型。该毒素通过不同的细胞内蛋白靶点发挥作用，表现出不同的效果持续时间及作用。就疗效而言，a型是唯一显示出临床上重要的生物活性毒素，因此是最常被研究及使用的血清型肉毒毒素，b型肉毒毒素也有一定的临床应用，主要用于治疗局部肌张力障碍。

2、a型和b型重组肉毒杆菌神经毒素是由重组肉毒表达菌株合成的单链蛋白质，这种单链蛋白质在一个特定的位置被一种蛋白酶切断，产生两条多肽链，分别为轻链和重链。这两条多肽链通过二硫键相连，形成了具有生物活性的双链结构。如图1所示,肉毒毒素蛋白由50 kda的轻链和100 kda的重链组成，轻链和重链之间由二硫键连接。其中100 kda的重链包括50 kda的hn和50 kda的hc。目前国内外已上市的所有a型和b型肉毒毒素的产品都来自致病性肉毒杆菌，生产过程蕴含较高的生物安全性风险。通过全新的重组蛋白的技术路线生产肉毒毒素可以显著降低生产过程生物安全风险、并大幅提高产品纯度。这条新技术路线是极为复杂的系统工程，门槛极高、难度极大。在过去的几十年里，全球仅有极个别的外国公司实现了重组蛋白肉毒毒素的生产。

3、目前制备重组肉毒杆菌神经毒素的方法主要有以下几种：

4、利用大肠杆菌作为宿主细胞，在其质粒中插入编码肉毒杆菌神经毒素轻链和重链的基因，并在轻链和重链之间加入连接多肽序列，使其在大肠杆菌中表达出具有神经酶活性的单链形式的重组肉毒杆菌神经毒素。

5、利用酵母细胞作为宿主细胞，在其质粒或基因组中插入编码肉毒杆菌神经毒素轻链和重链的基因，并在轻链和重链之间加入连接多肽序列，使其在酵母细胞中表达出不具有神经酶活性的单链形式的重组肉毒杆菌神经毒素，后续经纯化、酶切等步骤获得具有神经酶活性的重组肉毒杆菌神经毒素蛋白。

6、利用昆虫细胞-昆虫病毒表达系统，在昆虫病毒中插入编码肉毒杆菌神经毒素轻链和重链的基因，并在轻链和重链之间加入连接多肽序列，使其在昆虫细胞中表达出具有神经酶活性的单链形式的重组肉毒杆菌神经毒素。

7、利用哺乳动物细胞作为宿主细胞，在其基因组中插入编码肉毒杆菌神经毒素轻链和重链的基因，并在轻链和重链之间加入连接多肽序列，使其在哺乳动物细胞中表达出具有神经酶活性的单链形式或双链形式（通过二硫键连接）的重组肉毒杆菌神经毒素。

8、重组肉毒毒素具有广泛的应用前景，主要用于医学美容、神经系统疾病、皮肤科等领域。例如，注射用重组a型肉毒毒素可以用于改善中度至重度眉间纹、面部皱纹、面部瘫痪等。

9、因此，亟需一种操作简单、快捷、高效且通用的重组肉毒表达菌株制备方法，以极大缩短重组肉毒的研发及产业化的时间，降低安全风险，提高产品纯度，降低成本，提高产品收益。

技术实现思路

1、本发明的第一目的是提供一种重组肉毒杆菌神经毒素表达菌株，解决目前生产肉毒毒素的生产过程生物安全风险高，工艺复杂，门槛极高，难度极大的问题。

2、本发明的第二目的是提供上述重组肉毒杆菌神经毒素表达菌株的构建方法。

3、本发明通过以下技术方案来实现：

4、一、一种重组肉毒杆菌神经毒素表达菌株，该菌株是将肉毒杆菌神经毒素基因克隆到多形汉逊酵母（ hansenula polymorpha）基因组中后获得的基因工程重组菌株。

5、进一步的，所述的肉毒杆菌神经毒素基因选自a1、a2、a3、a4、a5、a6、a7、a8、b1、b2、b3、b4型肉毒杆菌神经毒素基因中的任意一种。

6、进一步的，所述的肉毒杆菌神经毒素基因选自a1、a6、b2型肉毒杆菌神经毒素基因中的任意一种。

7、进一步的，所述的a1型肉毒杆菌神经毒素基因的核苷酸序列如seq id no：1所示，翻译成的蛋白质的氨基酸序列如seq id no：2所示。

8、进一步的，该菌株为多形汉逊酵母（ hansenula polymorpha）rbn-a1，其保藏编号为cgmcc no.31883。

9、进一步的，所述的a6型肉毒杆菌神经毒素基因的核苷酸序列如seq id no：3所示，翻译成的蛋白质的氨基酸序列如seq id no：4所示。

10、进一步的，该菌株为多形汉逊酵母（ hansenula polymorpha）rbn-a6，其保藏编号为cgmcc no.31884。

11、进一步的，所述的b2型肉毒杆菌神经毒素基因的核苷酸序列如seq id no：5所示，翻译成的蛋白质的氨基酸序列如seq id no：6所示。

12、进一步的，菌株为多形汉逊酵母（ hansenula polymorpha）rbn-b2，其保藏编号为cgmcc no.31885。

13、二、一种构建重组肉毒杆菌神经毒素表达菌株的方法，该方法包括以下步骤：

14、（1）以全基因合成的方式得到重组肉毒杆菌神经毒素相关基因；

15、（2）将肉毒杆菌神经毒素相关基因连接到表达载体，转化至大肠杆菌克隆菌株，经筛选获得重组肉毒杆菌神经毒素质粒菌株；

16、（3）将所得重组质粒提取后转化至多形汉逊酵母细胞中。

17、采用上述技术方案的积极效果：本发明提供的重组肉毒表达菌株最高可耐受49℃高温，最适生长温度为37-43℃，能进行准确的翻译后加工，同时具有以甲醇为碳源和能源的代谢途径，可以达到高细胞密度发酵，稳定地生产外源蛋白。

技术特征：

1.一种重组肉毒杆菌神经毒素表达菌株，其特征在于：该菌株是将肉毒杆菌神经毒素基因克隆到多形汉逊酵母（hansenula polymorpha）基因组中后获得的基因工程重组菌株。

2.根据权利要求1所述的重组肉毒杆菌神经毒素表达菌株，其特征在于：所述的肉毒杆菌神经毒素基因选自a1、a2、a3、a4、a5、a6、a7、a8、b1、b2、b3、b4型肉毒杆菌神经毒素基因中的任意一种。

3.根据权利要求2所述的重组肉毒杆菌神经毒素表达菌株，其特征在于：所述的肉毒杆菌神经毒素基因选自a1、a6、b2型肉毒杆菌神经毒素基因中的任意一种。

4.根据权利要求3所述的重组肉毒杆菌神经毒素表达菌株，其特征在于：所述的a1型肉毒杆菌神经毒素基因的核苷酸序列如seq id no:1所示，翻译成的蛋白质的氨基酸序列如seq id no:2所示。

5.根据权利要求4所述的重组肉毒杆菌神经毒素表达菌株，其特征在于：该菌株为多形汉逊酵母（hansenula polymorpha）rbn-a1，其保藏编号为cgmcc no.31883。

6.根据权利要求3所述的重组肉毒杆菌神经毒素表达菌株，其特征在于：所述的a6型肉毒杆菌神经毒素基因的核苷酸序列如seq id no:3所示，翻译成的蛋白质的氨基酸序列如seq id no:4所示。

7.根据权利要求6所述的重组肉毒杆菌神经毒素表达菌株，其特征在于：该菌株为多形汉逊酵母（hansenula polymorpha）rbn-a6，其保藏编号为cgmcc no.31884。

8.根据权利要求3所述的重组肉毒杆菌神经毒素表达菌株，其特征在于：所述的b2型肉毒杆菌神经毒素基因的核苷酸序列如seq id no:5所示，翻译成的蛋白质的氨基酸序列如seq id no:6所示。

9.根据权利要求8所述的重组肉毒杆菌神经毒素表达菌株，其特征在于：该菌株为多形汉逊酵母（hansenula polymorpha）rbn-b2，其保藏编号为cgmcc no.31885。

10.一种构建重组肉毒杆菌神经毒素表达菌株的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

技术总结
本发明涉及一种重组肉毒杆菌神经毒素表达菌株，该菌株是将肉毒杆菌神经毒素基因克隆到多形汉逊酵母（Hansenula polymorpha）基因组中后获得的基因工程重组菌株。本发明提供的重组肉毒表达菌株最高可耐受49℃高温，最适生长温度为37‑43℃，能进行准确的翻译后加工，同时具有以甲醇为碳源和能源的代谢途径，可以达到高细胞密度发酵，稳定地生产外源蛋白。

技术研发人员：邹烨宁,杨金迪,孟令铎
受保护的技术使用者：北京赛尔祎生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2025/2/5