一种蝴蝶兰叶片可视化标记遗传转化的方法

本发明属于分子生物学和生物，具体一种蝴蝶兰叶片可视化标记遗传转化的方法。

背景技术：

1、花青素是一种天然水溶性色素，广泛分布于植物的各个部位，不仅赋予植物丰富的颜色，还增强植物对环境胁迫的抵御能力，如应对强光、紫外线和低温等。花青素作为一种安全无毒的天然色素，具有抗氧化等多种保健功能，广泛应用于食品、药品及化妆品等领域。花青素的生物合成途径和调控机制在矮牵牛、金鱼草、拟南芥等模式植物中已得到深入研究。花青素的生物合成由myb、bhlh和wd40三类主要转录因子调控，其中r2r3-myb对花青素合成调控尤为关键，能直接调控合成基因的表达，在花青素调控中起核心作用，决定植物最终的着色情况。

2、蝴蝶兰(phalaenopsis)属于兰科蝴蝶兰属，以其艳丽的花色、优雅的花型和持久的花期而成为兰科植物中栽培最广泛、最受欢迎的种类之一，被誉为“兰花皇后”，在观赏、生态和经济领域具有重要地位。蝴蝶兰性状改良(如花色、叶色、花型等)是遗传育种的主要目标，传统的蝴蝶兰遗传转化选择蝴蝶兰种子萌发的原球茎为转化受体，但此方法存在培养周期长，易产生嵌合体，转化效率低等诸多缺点，因此，建立一种能够快速在蝴蝶兰植株中进行性状检测和基因功能分析的方法显得尤为必要。瞬时转化方法通过根癌农杆菌介导，可快速评估外源基因的功能及预期表型。相比传统稳定转化，瞬时表达无需将t-dna整合至宿主基因组，具有操作简便、周期短、表达效率高等优点。此外，瞬时转化体系的建立为rna干扰，基因编辑等技术的应用提供了更多可能。目前蝴蝶兰瞬时转化体系已成功在花器官中转化，但国内外未见利用叶片作为转化受体的报道，这极大限制了特异性在叶片中表达基因的研究，因此需要开发一种能有效解决上述问题的蝴蝶兰叶片瞬时转化体系。

3、传统的植物遗传转化筛选主要依赖外源性筛选标记和报告基因(如gus、gfp、luc等)，但此方法存在肉眼不可辨识、检测复杂、破坏性高、受背景干扰等缺点。而植物内源性花青素作为新型报告基因，具备肉眼可见、无破坏性、检测简便、安全等优势，可用于转化子的早期筛选，目前已在烟草，苹果，橡胶，桑树等多种植物中得到应用，但是未有应用花青素作为筛选标记，应用于蝴蝶兰叶片瞬时转化体系的筛选的报道。

技术实现思路

1、为解决上述的技术问题，本发明提供了一种利用蝴蝶兰pemyb23基因诱导的花青素作为筛选标记的方法，该方法应用于蝴蝶兰叶片的瞬时转化筛选，将有望大幅提高蝴蝶兰叶片转基因筛选效率，具备检测简便、周期短、表达效率高等优点，可为蝴蝶兰的基因工程育种及分子生物学研究提供重要的技术支持。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一方面，本发明提供蝴蝶兰pemyb23基因作为转基因标记在筛选植物转基因材料中的应用，所述的蝴蝶兰pemyb23基因的核苷酸序列如seq id no:1所示，氨基酸序列如seqid no:2所示。

4、优选的，是以pemyb23基因诱导的花青素表型作为可视化标记，鉴别目标基因在植物中是否转化成功。

5、另一方面，本发明还提供蝴蝶兰pemyb23基因在调控植物花青素合成中的应用，所述的蝴蝶兰pemyb23基因的核苷酸序列如seq id no:1所示，氨基酸序列如seq id no:2所示。

6、优选的，通过过表达pemyb23基因，促进植物花青素合成。

7、优选的，所述的植物包括蝴蝶兰。

8、另一方面，本发明还提供一种蝴蝶兰叶片可视化标记遗传转化的方法，通过农杆菌介导将核苷酸序列如seq id no:1所示的pemyb23基因转入蝴蝶兰叶片，利用花青素的颜色变化进行快速筛选，实现转化子可视化、无破坏性地鉴定。

9、具体的，将目标基因与pemyb23基因同时构建至质粒载体中，得到重组质粒；将重组质粒导入农杆菌感受态细胞中，使其成为转化工程菌，通过注射法将含有重组质粒的农杆菌导入蝴蝶兰叶片，即得。

10、优选的，所述的农杆菌为根癌农杆菌eha105。

11、优选的，所述将重组质粒导入农杆菌感受态细胞中的方法包括电穿孔、热激或化学转化等方法。

12、本发明具有以下有益效果：

13、本发明方法通过农杆菌介导将pemyb23基因转入蝴蝶兰叶片，利用花青素的颜色变化进行快速筛选，从而实现转化子可视化、无破坏性地鉴定。与传统遗传转化方法相比，本发明无需依赖外源报告基因和筛选标记，具备操作简便、周期短、表达效率高、易于观察等优点。实施过程包括pemyb23基因的克隆及载体构建、重组质粒的工程菌转化、叶片的瞬时转化及花青素积累的检测。最终建立的瞬时转化体系，可通过将目标基因与pemyb23基因同时构建至重组质粒，通过花青素积累情况实现对目标基因转化效率的早期评估，为蝴蝶兰基因工程育种、分子生物学研究及功能基因的探索提供了新的技术途径。本发明的技术不仅适用于蝴蝶兰，还具有在其他植物遗传转化及筛选中的广泛应用潜力。

技术特征：

1.蝴蝶兰pemyb23基因作为转基因标记在筛选植物转基因材料中的应用，所述的蝴蝶兰pemyb23基因的核苷酸序列如seq id no:1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的蝴蝶兰pemyb23基因的氨基酸序列如seq id no:2所示。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，以pemyb23基因诱导的花青素表型作为可视化标记，鉴别目标基因在植物中是否转化成功。

4.蝴蝶兰pemyb23基因在调控植物花青素合成中的应用，所述的蝴蝶兰pemyb23基因的核苷酸序列如seq id no:1所示。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的蝴蝶兰pemyb23基因的氨基酸序列如seq id no:2所示。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，通过过表达pemyb23基因，促进植物花青素合成。

7.根据权利要求1或4所述的应用，其特征在于，所述的植物包括蝴蝶兰。

8.一种蝴蝶兰叶片可视化标记遗传转化的方法，其特征在于，通过农杆菌介导将核苷酸序列如seq id no:1所示的pemyb23基因转入蝴蝶兰叶片，利用花青素的颜色变化进行快速筛选，实现转化子可视化、无破坏性地鉴定。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：将目标基因与pemyb23基因同时构建至质粒载体中，得到重组质粒；将重组质粒导入农杆菌感受态细胞中，使其成为转化工程菌，通过注射法将含有重组质粒的农杆菌导入蝴蝶兰叶片，即得。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的农杆菌为根癌农杆菌eha105。

技术总结
本发明公开了一种蝴蝶兰叶片可视化标记遗传转化的方法。该方法通过农杆菌介导将PeMYB23基因转入蝴蝶兰叶片，利用花青素的颜色变化进行快速筛选，从而实现转化子可视化、无破坏性地鉴定。实施过程包括PeMYB23基因的克隆及载体构建、重组质粒的工程菌转化、叶片的瞬时转化及花青素积累的检测。最终建立的瞬时转化体系，可通过将目标基因与PeMYB23基因同时构建至重组质粒，通过花青素积累情况实现对目标基因转化效率的早期评估，为蝴蝶兰基因工程育种、分子生物学研究及功能基因的探索提供了新的技术途径。本发明的技术不仅适用于蝴蝶兰，还具有在其他植物遗传转化及筛选中的广泛应用潜力。

技术研发人员：李季,曾宋君,房林,曾晶珏,吴坤林,李琳,陈砚
受保护的技术使用者：中国科学院华南植物园
技术研发日：
技术公布日：2025/2/20