一种基于荧光淬灭的引物标记方法及应用与流程

本发明涉及引物标记，尤其涉及一种基于荧光淬灭的引物标记方法及应用。

背景技术：

1、实时荧光pcr检测技术同时具备灵敏度高、特异性强、简便快速、成本低等多种优点，是生物分子检测最常用的方法。目前多重荧光pcr方法基本上是荧光探针技术或荧光染料法进行检测。荧光探针技术，即把荧光基团标记在探针上，如taqman技术、beacon技术、fret技术等。这些方法均通过标记在探针上的不同波长激发光的荧光素分子实现多个靶标的检测。缺点是，在同一荧光通道不能区分不同的扩增片段产物、检测突变的能力不足、不能进行解离曲线分析。且其可检测靶标有限，其单管可检测靶标数量受荧光通道的制约。而荧光染料法是对双链dna产物的无差别标记，常用于检测单一靶标，限制了其在多重荧光pcr技术上的应用。

2、专利号为cn114875116a的专利文件阐述了一种自淬灭荧光的引物及其设计方法及应用，其荧光标记在引物上而不是探针上，其引物序列特征在于荧光基团标记到紧按着g碱基的碱基上，使引物荧光进行淬灭，而扩增产物带有荧光信号。但该方案因把荧光标记位置从探针上移到了引物上，其原理依据荧光强度与扩增产物成正比，与探针标记、荧光染料标记原理基本一致。因此只是荧光探针技术或荧光染料法的一种替代方案。且扩增产物中g碱基仍然紧按荧光基团，原始引物与产物之间荧光差异小，灵敏度及区分度小于荧光探针技术或荧光染料法。

技术实现思路

1、针对背景技术中存在的问题，提出一种基于荧光淬灭的引物标记方法及应用，有效拓宽经典荧光探针技术或荧光染料法技术检测靶标数，且不影响荧光探针法或荧光染料法高灵敏度特征。

2、本发明提出一种基于荧光淬灭的引物标记方法，步骤如下：

3、s1、在引物富含c碱基的区域进行荧光标记；

4、s2、利用产物扩增技术处理上述的荧光标记引物，使其形成双链dna结构，此时与c碱基互补的g碱基会对该荧光标记基团进行淬灭；

5、s3、通过荧光定量技术，对上述的双链dna结构进行解离，使得g碱基远离对应的荧光标记基团，淬灭效应消失，荧光信号释放；

6、s4、借助定量仪器制作解离曲线，并形成倒置解离曲线；

7、s5、对上述的倒置解离曲线进行分析，得到引物在温度变化时双链解离的热力学特征。

8、优选的，荧光标记位置为引物本身富含c碱基的区域或在5’末端人工添加富含c碱基的区域。

9、优选的，对引物末端区域进行荧光标记时，标记荧光碱基为c，标记序列为c*c或c*cc；c*表示被标记的碱基c。

10、优选的，对引物内部区域进行荧光标记时，标记荧光碱基为t，标记序列为ct*c或cct*cc；t*表示被标记的碱基t。

11、优选的，人工添加在引物5’末端的富含c碱基序列无需与扩增模板序列匹配。

12、优选的，选择的荧光标记基团为fam、vic、hex、tet、rox、tamra、joe、cy3或cy5中的任一种。

13、优选的，解离曲线上峰值对应的温度反映扩增产物的tm值。

14、本发明又提出一种包括上述的基于荧光淬灭的引物标记方法的应用，通过与荧光探针法或荧光染料法联用，应用于多标靶检测领域。

15、优选的，检测多个靶标时，通过对引物标记不同荧光，同时结合不同产物解离曲线上倒置峰对应温度的不同，来对靶标扩增产物进行鉴定。

16、优选的，检测多个靶标时，利用不同荧光(n种)和不同产物解离温度(m种)的差异，产生n＊m种不同组合。

17、与现有技术相比，本发明具有如下有益的技术效果：

18、本发明中的引物标记方法简单，只需要在普通引物富含c碱基区域或在5’末端人工添加富c碱基区域进行荧光标记即可。接着利用产物扩增技术处理上述的荧光标记引物，使其形成双链dna结构。然后通过荧光定量技术，对上述的双链dna结构进行解离，制作解离曲线。最后对上述的倒置解离曲线进行分析，得到引物在温度变化时双链解离的热力学特征。该方法具有背景信号低，pcr产物淬灭效果良好的特点。可与荧光探针法或荧光染料法联用，有效拓宽经典荧光探针技术或荧光染料法技术检测靶标数。且不影响荧光探针法或荧光染料法高灵敏度特征。

技术特征：

1.一种基于荧光淬灭的引物标记方法，其特征在于，步骤如下：

2.根据权利要求1所述的一种基于荧光淬灭的引物标记方法，其特征在于，荧光标记位置为引物本身富含c碱基的区域或在5’末端人工添加富含c碱基的区域。

3.根据权利要求2所述的一种基于荧光淬灭的引物标记方法，其特征在于，对引物末端区域进行荧光标记时，标记荧光碱基为c，标记序列为c*c或c*cc；c*表示被标记的碱基c。

4.根据权利要求2所述的一种基于荧光淬灭的引物标记方法，其特征在于，对引物内部区域进行荧光标记时，标记荧光碱基为t，标记序列为ct*c或cct*cc；t*表示被标记的碱基t。

5.根据权利要求2所述的一种基于荧光淬灭的引物标记方法，其特征在于，人工添加在引物5’末端的富含c碱基序列无需与扩增模板序列匹配。

6.根据权利要求1所述的一种基于荧光淬灭的引物标记方法，其特征在于，选择的荧光标记基团为fam、vic、hex、tet、rox、tamra、joe、cy3或cy5中的任一种。

7.根据权利要求1所述的一种基于荧光淬灭的引物标记方法，其特征在于，解离曲线上峰值对应的温度反映扩增产物的tm值。

8.一种包括权利要求1-7任一项所述的基于荧光淬灭的引物标记方法的应用，其特征在于，通过与荧光探针法或荧光染料法联用，应用于多标靶检测领域。

9.根据权利要求8所述的一种基于荧光淬灭的引物标记方法的应用，其特征在于，检测多个靶标时，通过对引物标记不同荧光，同时结合不同产物解离曲线上倒置峰对应温度的不同，来对靶标扩增产物进行鉴定。

10.根据权利要求9所述的一种基于荧光淬灭的引物标记方法的应用，其特征在于，检测多个靶标时，利用不同荧光和不同产物解离温度的差异，产生多种不同组合。

技术总结
本发明涉及引物标记技术领域，尤其涉及一种基于荧光淬灭的引物标记方法及应用。本发明中的引物标记方法简单，只需要在普通引物富含C碱基区域或在5’末端人工添加富C碱基区域进行荧光标记即可。接着利用产物扩增技术处理上述的荧光标记引物，使其形成双链DNA结构。然后通过荧光定量技术，对上述的双链DNA结构进行解离，制作解离曲线。最后对上述的倒置解离曲线进行分析，得到引物在温度变化时双链解离的热力学特征。该方法具有背景信号低，PCR产物淬灭效果良好的特点。可与荧光探针法或荧光染料法联用，有效拓宽经典荧光探针技术或荧光染料法技术检测靶标数。且不影响荧光探针法或荧光染料法高灵敏度特征。

技术研发人员：刘红星,陈佳琦,王芳,张阳,陈雪,陈奇辉
受保护的技术使用者：北京知因谱科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2025/3/3