一种共同表达新城疫病毒F基因和传染性法氏囊病毒新型变异株VP2基因的重组马立克氏病病毒及其应用

本发明属于基因工程疫苗领域，具体是涉及共同表达新城疫病毒f基因和传染性法氏囊病毒新型变异株vp2基因的重组马立克氏病病毒及其应用。

背景技术：

1、鸡马立克氏病（md）、新城疫（nd）和传染性法氏囊病（ibd）是鸡的三大疫病，各类鸡群必须采用疫苗进行免疫防控。现地新城疫病毒（ndv）和传染性法氏囊病毒（ibdv）常发生混合感染，然而目前尚缺乏一种能够不受母源抗体干扰，适于孵化场一日龄雏鸡早期免疫的疫苗用于上述疫病的联合免疫。自1982年在我国首次报道以来，ibdv感染在我国大部分养禽地区广泛流行。2017年以来，我国和周边国家相继出现非典型ibd疫情，患病鸡群生产性能和免疫机能低下，剖检可见法氏囊严重萎缩，经鉴定引起该疫情的病原为ibdv新型变异株（varibdv）。目前ibdv新型变异株在我国广泛流行，但市场上使用的商品化ibd疫苗却不能对该变异毒株提供良好的免疫保护，进而造成感染鸡群产生严重的免疫抑制，成为目前影响我国养禽业健康发展的新威胁。

2、鸡马立克氏病病毒（mdv）能引起鸡的高度传染性、淋巴组织增生性、免疫抑制性肿瘤病。血清1型mdv弱毒活疫苗cvi988株在国内外被广泛用于鸡马立克氏病的防控。mdv属于疱疹病毒，基因组较大，可供外源基因插入或替换的复制非必需基因多，是一种理想的构建重组活载体疫苗的病毒载体。mdv复制具有严格的细胞结合性，病毒在细胞间传播，不受母源抗体干扰，适于早期免疫，疫苗可以胚内免疫或在鸡一日龄时免疫，免疫抗体产生早。mdv感染后机体终身带毒，可持续表达外源蛋白抗原，诱导抗体产生，从而使机体产生持久的免疫力。另外，mdv 的自然宿主只有禽类，对其他动物和人类是安全的。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种共同表达新城疫病毒f基因和传染性法氏囊病毒新型变异株vp2基因的重组马立克氏病病毒。

2、本发明的目的还在于提供一种共同表达新城疫病毒f基因和传染性法氏囊病毒新型变异株vp2基因的重组马立克氏病病毒的构建方法。

3、本发明的目的还在于提供一种共同表达新城疫病毒f基因和传染性法氏囊病毒新型变异株vp2基因的重组马立克氏病病毒的应用。

4、为实现以上技术目的，本发明采用如下技术方案：

5、一种共同表达新城疫病毒f基因和传染性法氏囊病毒新型变异株vp2基因的重组马立克氏病病毒，所述重组马立克氏病病毒是将包含鸡β肌动蛋白启动子、新城疫病毒f基因和传染性法氏囊病毒新型变异株vp2基因编码序列f2aa2、土拨鼠肝炎病毒转录后调节序列、兔β球蛋白多聚腺苷酸序列的表达框架cagw-f2aa2插入马立克氏病病毒基因组后获得的。

6、所述编码序列f2aa2是由新城疫病毒f基因编码序列和传染性法氏囊病毒新型变异株vp2基因编码序列以猪捷申病毒2a自剪切肽编码序列连接获得，所述编码序列f2aa2的核苷酸序列如seq id no.1所示。

7、所述表达框架cagw-f2aa2是将f2aa2克隆入pcaggs载体的鸡β肌动蛋白启动子和兔β球蛋白多聚腺苷酸序列之间，并将土拨鼠肝炎病毒转录后调节序列插入f2aa2序列与兔β球蛋白多聚腺苷酸序列之间获得的，所述表达框架cagw-f2aa2的核苷酸序列如seq idno.2所示。

8、所述重组马立克氏病病毒是将含有血清1型马立克氏病病毒cvi988株基因组dna片段的重组黏粒c1、c2、c3、c5、c6以及含有新城疫病毒f基因和传染性法氏囊病毒新型变异株vp2基因表达框架的重组黏粒c4-45-f2aa2共转染cef细胞后，通过病毒拯救获得的；所述的重组黏粒c1、c2、c3、c5、c6分别含有马立克氏病病毒cvi988株基因组第1-37644位、第29969-68579位，第60962-99647位、第115670-152340、第143712-178311位核苷酸片段；所述的重组黏粒c4-45-f2aa2是在c4的基础上，在cvi988株基因组第105561-105563位核苷酸之间插入表达框架cagw-f2aa2后获得的，所述的重组黏粒c4包含cvi988株基因组第91415-126182位核苷酸片段。

9、所述表达框架cagw-f2aa2插入在马立克氏病病毒cvi988株基因组第105561-105563位核苷酸之间。

10、一种所述的共同表达新城疫病毒f基因和传染性法氏囊病毒新型变异株vp2基因的重组马立克氏病病毒在制备新城疫、鸡传染性法氏囊病和鸡马立克氏病疫苗中的应用。

11、本发明利用重组克隆技术，将包含新城疫病毒基因vii型毒株f基因和传染性法氏囊病毒新型变异株vp2基因的表达框架插入到马立克病毒cvi988株基因组的105561-105563位核苷酸之间，构建了共同表达新城疫病毒f基因和传染性法氏囊病毒新型变异株vp2基因的重组马立克氏病病毒疫苗株c20103株。将该重组病毒疫苗株免疫无特定病原体（spf）鸡后，能使spf鸡获得对新城疫病毒基因vii型强毒株、传染性法氏囊病毒新型变异株以及鸡马立克氏病病毒强毒株的免疫保护，可以用于新城疫、鸡传染性法氏囊病和鸡马立克氏病疫苗的制备。

12、本发明提供的重组马立克氏病病毒制备的疫苗能够同时提供针对新城疫病毒、传染性法氏囊病毒新型变异株以及鸡马立克氏病强毒感染的多重保护，具有良好的市场应用前景。

技术特征：

1.一种共同表达新城疫病毒f基因和传染性法氏囊病毒新型变异株vp2基因的重组马立克氏病病毒，其特征在于，所述重组马立克氏病病毒是将包含鸡β肌动蛋白启动子、新城疫病毒f基因和传染性法氏囊病毒新型变异株vp2基因编码序列f2aa2、土拨鼠肝炎病毒转录后调节序列、兔β球蛋白多聚腺苷酸序列的表达框架cagw-f2aa2插入鸡马立克氏病病毒基因组后获得；

2.根据权利要求1所述的共同表达新城疫病毒f基因和传染性法氏囊病毒新型变异株vp2基因的重组马立克氏病病毒，其特征在于，所述重组马立克氏病病毒是将含有血清1型鸡马立克氏病病毒cvi988株基因组dna片段的重组黏粒c1、c2、c3、c5、c6以及含有新城疫病毒f基因和传染性法氏囊病毒新型变异株vp2基因表达框架的重组黏粒c4-45-f2aa2共转染cef细胞后，通过病毒拯救获得的；所述的重组黏粒c1、c2、c3、c5、c6分别含有马立克氏病病毒cvi988株基因组第1-37644位、第29969-68579位，第60962-99647位、第115670-152340、第143712-178311位核苷酸片段；所述的重组黏粒c4-45-f2aa2是在c4的基础上，在cvi988株基因组第105561-105563位核苷酸之间插入表达框架cagw-f2aa2后获得的，所述的重组黏粒c4包含cvi988株基因组第91415-126182位核苷酸片段。

3.一种如权利要求1所述的共同表达新城疫病毒f基因和传染性法氏囊病毒新型变异株vp2基因的重组马立克氏病病毒在制备新城疫、鸡传染性法氏囊病和鸡马立克氏病疫苗中的应用。

技术总结
本发明提供了一种共同表达新城疫病毒F基因和传染性法氏囊病毒新型变异株VP2基因的重组马立克氏病病毒及其应用，属于基因工程疫苗领域。本发明利用重组克隆技术，将包含新城疫病毒基因VII型毒株F基因和传染性法氏囊病毒新型变异株VP2基因的表达框架插入到血清1型鸡马立克氏病病毒CVI988株基因组的105561‑105563位核苷酸之间，构建获得在鸡马立克氏病病毒基因组中插入新城疫病毒F基因和传染性法氏囊病毒新型变异株VP2基因表达框架的重组黏粒，由其拯救获得共同表达新城疫病毒F基因和传染性法氏囊病毒新型变异株VP2基因的重组病毒C20103株。本发明提供的重组鸡马立克氏病病毒制备的疫苗能够同时预防新城疫、鸡传染性法氏囊病和鸡马立克氏病，具有良好的市场应用前景。

技术研发人员：李凯,田世茂,王笑梅,李晓涵,李守军,车艳杰,朱秀同
受保护的技术使用者：中国农业科学院都市农业研究所
技术研发日：
技术公布日：2025/1/9