多项念珠菌核酸检测试剂盒及检测方法与流程

本发明属于生物检测，尤其是涉及一种多项念珠菌核酸检测试剂盒及检测方法。

背景技术：

1、近年来、越来越多的念珠菌感染案例发生，尤其是在免疫功能低下的患者中，如癌症患者、hiv感染者、接受器官移植者等。念珠菌感染不仅影响患者的生活质量，还可能引发严重的并发症，甚至危及生命。根据世界卫生组织（who）的统计数据，全球每年约有数百万例念珠菌感染病例，其中约有40%的病例发生在免疫功能低下的患者中。这些患者由于免疫系统功能减弱，更易受到念珠菌的侵袭，感染后更难以治愈，死亡率也相对较高。

2、在念珠菌属中，白色念珠菌（candida albicans）、克柔念珠菌（candida krusei）、光滑念珠菌（candida glabrata）、热带念珠菌（candida tropicalis）和近平滑念珠菌（candida parapsilosis）是临床上最常见的致病菌种。不同种类的念珠菌对抗真菌药物的敏感性不同，例如，克柔念珠菌对氟康唑（fluconazole）具有天然耐药性，而光滑念珠菌则常表现出多重耐药性，因此，临床医生在选择抗真菌治疗方案时，必须根据具体的念珠菌种类做出最合适的决策。因此，准确、快速地识别和分型这些念珠菌对临床诊断和治疗具有重要意义。

3、现有的念珠菌检测方法在临床应用中存在诸多不足。传统的培养法需要数天时间才能获得结果，且灵敏度和特异性有限，容易出现漏检和误检的情况。显微镜检查虽然可以在短时间内观察到念珠菌，但无法准确分型，且需要专业技术人员操作。免疫荧光法可能出现非特异性染色，导致背景荧光干扰。非特异性染色增加了解释结果的难度，影响检测的灵敏度和特异性。此外，免疫荧光法对样本的保存和处理要求较高，样本需要保持良好的形态和抗原性。样本保存不当或处理不当可能导致抗原降解或丢失，影响检测结果的准确性。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供一种多项念珠菌核酸检测试剂盒及检测方法。

2、本发明采用的技术方案是：一种用于检测多项念珠菌的引物探针组，包括分别检测白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌和近平滑念珠菌中至少两种菌种的特异性正向引物、特异性反向引物和特异性探针；

3、其中，用于检测白色念珠菌的特异性正向引物、特异性反向引物和特异性探针序列分别为seq id no.1、seq id no.2和seq id no.3所示；

4、用于检测克柔念珠菌的特异性正向引物、特异性反向引物和特异性探针序列分别为seq id no.4、seq id no.5和seq id no.6所示；

5、用于检测光滑念珠菌的特异性正向引物、特异性反向引物和特异性探针序列分别为seq id no.7、seq id no.8和seq id no.9所示；

6、用于检测热带念珠菌的特异性正向引物、特异性反向引物和特异性探针序列分别为seq id no.10、seq id no.11和seq id no.12所示；

7、用于检测近平滑念珠菌的特异性正向引物、特异性反向引物和特异性探针序列分别为seq id no.13、seq id no.14和seq id no.15所示。

8、优选地，白色念珠菌特异性探针和克柔念珠菌特异性探针中包含第一荧光报告基因；光滑念珠菌特异性探针中包含第二荧光报告基因；热带念珠菌特异性探针和近平滑念珠菌特异性探针中包含第三荧光报告基因。

9、优选地，第一荧光报告基因、第二荧光报告基因和第三荧光报告基因分别为fam、vic和cy5；白色念珠菌特异性探针、克柔念珠菌特异性探针、光滑念珠菌特异性探针、热带念珠菌特异性探针和近平滑念珠菌特异性探针中均包括mgb。

10、优选地，包括分别检测白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌和近平滑念珠菌的特异性正向引物、特异性反向引物和特异性探针。

11、一种多项念珠菌核酸检测试剂盒，包括用于检测多项念珠菌的引物探针组。

12、优选地，还包括阳性质控品，阴性质控品和检测反应液，其中检测反应液中包括引物探针组；

13、优选地，阳性质控品包括人工模拟肺泡灌洗液、含白色念珠菌基因组的溶液、含克柔念珠菌基因组的溶液、含光滑念珠菌基因组的溶液、含热带念珠菌基因组的溶液、含近平滑念珠菌基因组的溶液；阴性质控品为无菌无酶的去离子水。

14、优选地，还包括检测内参基因rnase p的特异性正向引物、特异性反向引物和特异性探针，序列分别为seq id no.16、seq id no.17和seq id no.18所示。

15、一种检测多类念珠菌的方法，使用用于检测多项念珠菌的引物探针组进行检测，或者使用多项念珠菌核酸检测试剂盒进行检测。

16、优选地，结合荧光报告基因特征峰是否显现，以及特征峰位置对样本念珠菌进行定性。

17、优选地，白色念珠菌特异性探针和克柔念珠菌特异性探针中包含第一荧光报告基因；在第一荧光报告基因显色通道中，特征峰的tm值在71.5~74.5℃，则判定为白色念珠菌阳性；tm值在78.3~80.7℃，则判定为克柔念珠菌阳性；若无特征峰或者tm值不在71.5~74.5℃与78.3~80.7℃之间，则为白色念珠菌阴性，克柔念珠菌阴性；

18、光滑念珠菌特异性探针中包含第二荧光报告基因；在第二荧光报告基因显色通道中，特征峰的tm值在72.5~74.7℃，则判定为光滑念珠菌阳性；若无特征峰或者tm值不在72.5~74.7℃之间，则为光滑念珠菌阴性；

19、热带念珠菌特异性探针和近平滑念珠菌特异性探针中包含第三荧光报告基因，在第二荧光报告基因显色通道中，特征峰的tm值在70.2~72.1℃，则判定为热带念珠菌阳性；tm值在76.5~78.7℃，则判定为近平滑念珠菌阳性；若无特征峰或者tm值不在70.2~72.1℃与76.5~78.7℃之间，则为热带念珠菌阴性，近平滑念珠菌阴性。

20、本发明具有的优点和积极效果是：提供一组能够同时检测多种念珠菌的引物组及试剂盒，设计特定针对白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌和近平滑念珠菌的引物及探针，在探针中加入荧光报告基因，结合荧光显色情况及峰值位置，可对白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌和近平滑念珠菌的类别进行定性；本方法检测特异性高，灵敏度高，准确率高，且检测效率高。

技术特征：

1.一种用于检测多项念珠菌的引物探针组，其特征在于：包括分别检测白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌和近平滑念珠菌中至少两种菌种的特异性正向引物、特异性反向引物和特异性探针；

2.根据权利要求1所述的用于检测多项念珠菌的引物探针组，其特征在于：白色念珠菌特异性探针和克柔念珠菌特异性探针中包含第一荧光报告基因；光滑念珠菌特异性探针中包含第二荧光报告基因；热带念珠菌特异性探针和近平滑念珠菌特异性探针中包含第三荧光报告基因。

3.根据权利要求2所述的用于检测多项念珠菌的引物探针组，其特征在于：第一荧光报告基因、第二荧光报告基因和第三荧光报告基因分别为fam、vic和cy5；白色念珠菌特异性探针、克柔念珠菌特异性探针、光滑念珠菌特异性探针、热带念珠菌特异性探针和近平滑念珠菌特异性探针中均包括mgb。

4.根据权利要求1-3中任一所述的用于检测多项念珠菌的引物探针组，其特征在于：包括分别检测白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌和近平滑念珠菌的特异性正向引物、特异性反向引物和特异性探针。

5.一种多项念珠菌核酸检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1-4中任一所述的用于检测多项念珠菌的引物探针组。

6.根据权利要求5所述的多项念珠菌核酸检测试剂盒，其特征在于：还包括阳性质控品，阴性质控品和检测反应液，其中检测反应液中包括引物探针组；

7.根据权利要求6所述的多项念珠菌核酸检测试剂盒，其特征在于：还包括检测内参基因rnase p的特异性正向引物、特异性反向引物和特异性探针，序列分别为seq id no.16、seq id no.17和seq id no.18所示。

8.一种检测多类念珠菌的方法，其特征在于：使用权利要求1-4中任一所述的引物探针组进行检测，或者使用权利要求5-7中任一所述的试剂盒进行检测。

9.根据权利要求8所述的检测多类念珠菌的方法，其特征在于：结合荧光报告基因特征峰是否显现，以及特征峰位置对样本念珠菌进行定性。

10.根据权利要求9所述的检测多类念珠菌的方法，其特征在于：白色念珠菌特异性探针和克柔念珠菌特异性探针中包含第一荧光报告基因；在第一荧光报告基因显色通道中，特征峰的tm值在71.5~74.5℃，则判定为白色念珠菌阳性；tm值在78.3~80.7℃，则判定为克柔念珠菌阳性；若无特征峰或者tm值不在71.5~74.5℃与78.3~80.7℃之间，则为白色念珠菌阴性，克柔念珠菌阴性；

技术总结
本发明涉及一种多项念珠菌核酸检测试剂盒及检测方法，能够同时实现对白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌和近平滑念珠菌五种致病真菌的联合定性检测；利用白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌和近平滑念珠菌的特异性引物以及特异性探针，结合聚合酶链式反应及荧光探针技术，分别对白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌和近平滑念珠菌高保守特异性的序列进行扩增检测，对五种菌进行定性检测。本方法检测特异性高，灵敏度高，准确率高，且检测效率高。

技术研发人员：赵明明,李可可,赵滨宇,马瑞聪,赵芷萌,李佳,苑庆华,何永胜,张晓光
受保护的技术使用者：天津一瑞生物科技股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2025/1/9